Axin1基因多態(tài)性與隱睪易感性的相關(guān)性研究

唐鐵龍，黃靜，鄒兵，譚春林，付劍，李鑫

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科·泌尿生殖疾病研究室，四川 南充 637000)

隱睪是新生男孩中最常見的先天性異常，影響3.5%的男性新生兒[1]。雖然常被認(rèn)為是一種中度畸形，但其是不育和睪丸癌最主要的危險(xiǎn)因素。研究表明隱睪是多因素導(dǎo)致的疾病[2]，大量的研究支持遺傳因素在隱睪發(fā)病中的作用[3-4]。

體軸抑制因子(axis formation inhibitior,Axin)，最初是從小鼠的分析鑒定融合基因，在胚胎發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的作用。Axin1是與多種蛋白反應(yīng)的多結(jié)構(gòu)域的腳手架蛋白并且通過B-聯(lián)蛋白復(fù)合體在WNT信號(hào)通路中作為一個(gè)關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控因子。研究表明，WNT信號(hào)通路在隱睪的疾病發(fā)展中起做至關(guān)重要的作用[5-9]。此外，Axin1不僅參與調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路，也參與調(diào)節(jié)TGF-β、SAPK /JNK和p53信號(hào)通路[10-11]。對(duì)老鼠的研究表明Axin1功能完全失活導(dǎo)致早期胚胎致死率在9.5 d，并伴有前腦截?cái)啵窠?jīng)管缺陷，和胚胎軸重復(fù)。Axin1可能參與胚胎和出生后的發(fā)育與疾病[12-13]。因此，隱睪風(fēng)險(xiǎn)和Axin1基因可能有關(guān)聯(lián)。

Axin1基因位于染色體16p13.3 的一個(gè)65 kb的區(qū)域內(nèi)。為了研究Axin1是否與隱睪的發(fā)病相關(guān)，實(shí)驗(yàn)在中國(guó)漢族人中散發(fā)的113例隱睪患者和179名健康對(duì)照人群研究了Axin1的3個(gè)標(biāo)簽SNPs和隱睪發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

研究獲得川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者的父母提供書面同意。實(shí)驗(yàn)組收集113例隱睪患者和179名不相關(guān)健康志愿者。實(shí)驗(yàn)組來(lái)自2008年9月到2012年6月入住川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院患者?；純撼錾蟪Ｒ?guī)體檢并且在3個(gè)月齡重復(fù)體檢，應(yīng)用SCORERK定義隱睪及體檢結(jié)果。所有的檢查都是在溫暖的環(huán)境下嬰兒仰臥位的條件下進(jìn)行的。將睪丸沿正常下降途徑的熟練操作到最末端的位置記錄睪丸的位置，但不使用暴力扭轉(zhuǎn)?；純?歲左右行睪丸固定術(shù)之前再次確認(rèn)診斷。單側(cè)隱睪92例，雙側(cè)隱睪21例；其中腹股溝淺袋32例，陰囊前間隙28例，外環(huán)27例，腹股溝管內(nèi)17例，內(nèi)環(huán)9例。對(duì)照組來(lái)源于包皮環(huán)切術(shù)患兒，年齡1個(gè)月～10歲，平均年齡(3.8±1.2)歲。早產(chǎn)或低出生體重的任何個(gè)人史或家族史的隱睪癥或其他嚴(yán)重疾病被排除在外(包括患兒和對(duì)照組)。所有的病例都來(lái)自居住在中國(guó)西南的四川漢族人。

1.2 SNP的篩選及基因分型

標(biāo)簽SNP在基因組某個(gè)區(qū)域中具有高度連鎖不平衡(2個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的等位基因的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)性)的代表性SNP。根據(jù)標(biāo)簽SNP基因分型在HapMap計(jì)劃的CHB人口抽樣數(shù)據(jù)選擇標(biāo)簽SNPs。Axin1基因的標(biāo)簽SNPs位于內(nèi)含子區(qū)域的rs370681，rs12921862和位于同義密碼區(qū)域的rs1805105，是從國(guó)際性HAMMAP項(xiàng)目(http://WWW.hapmap.org/index,html.zh)用tagger parwi-seTagging算法為中國(guó)北京的漢族人中挑選出來(lái)的。每個(gè)個(gè)體基因組DNA是通過DNA提取試劑盒提取bioteke(北京，中國(guó))從200 mL EDTA抗凝外周血樣本的。并按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作程序。

引物順序和DNA序列分析的限制性內(nèi)切酶見表1。隨機(jī)抽取10%的樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果與之前的結(jié)果100%一致。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的數(shù)據(jù)分析都是運(yùn)用的SPSS 17.0軟件。3個(gè)SNP的基因型頻率是通過直接計(jì)算所得到，HARDY-WEINBERG平衡是通過方差檢驗(yàn)評(píng)估得到呈現(xiàn)共顯性，顯性，隱性，超顯性或者Log-additive遺傳模型病例-對(duì)照模型基因型關(guān)聯(lián)測(cè)驗(yàn)是用SNPstates完成。

OR值和95%CI評(píng)價(jià)等位基因與基因型間的差異性。P<0.05被認(rèn)為在隱睪患者和健康對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列和酶

2 結(jié)果

3個(gè)標(biāo)簽SNP在113例隱睪癥患者和179名對(duì)照者中都被成功地基因分型。3個(gè)多態(tài)性的基因型分布符合hardye-weinberg平衡。Axin1基因標(biāo)簽SNPs等位基因頻率見表2。隱睪患者rs370681位點(diǎn)中T等位基因頻率明顯高于對(duì)照組(P=2e-4，OR1.96，95%CI 1.37～2.78)但rs1805105和rs12921862多態(tài)性的等位基因頻率在隱睪患者和對(duì)照組之間沒有差異(P=0.119，OR0.732，95%CI 0.502～1.067；P=0.245，OR1.572，95%CI 0.785～3.148)。

如表3所顯示，患者和對(duì)照組的rs370681多態(tài)性分布明顯不同。與C/C基因型相比，C/T基因型攜帶者隱睪癥的風(fēng)險(xiǎn)增加2.17倍(P= 6e-04，95%CI1.28～3.70)。而且在共顯性組中T/T基因型隱睪風(fēng)險(xiǎn)增高4倍(P=6e-04，95%CI 1.79～9.09)與C/C基因型相比，在顯性組中C/T-T/T基因型隱睪風(fēng)險(xiǎn)增高2.44倍(P=4e-04，95%CI 1.47～4.00)。同時(shí)，與C/C-C/T相比較，T/T基因型隱睪風(fēng)險(xiǎn)增高2.56倍(P=0.012，95%CI 1.22～5.26)。

此外，觀察到rs1805105多態(tài)性的基因型差異顯著。與T/T相比較，C/C-C/T基因型隱睪風(fēng)險(xiǎn)增高1.64倍(P=0.041，95%CI 1.02～2.63)，此外，與T/T-C/C基因型相比，C/T基因型攜帶者隱睪癥風(fēng)險(xiǎn)增加1.72倍(P=0.032，95%CI 1.05～2.86)。在rs12921862多態(tài)性與隱睪癥風(fēng)險(xiǎn)的遺傳模型中沒有觀察到顯著的關(guān)聯(lián)。

表2 Axin1標(biāo)簽SNPs等位基因頻率與隱睪患病相關(guān)性[n(%)]

表3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Axin1標(biāo)簽SNPs基因型頻率與隱睪患病相關(guān)性[n(%)]

3 討論

隱睪，也稱睪丸下降不全，是新生男孩的一種最常見的先天性異常[14]，并且被認(rèn)為是睪丸癌形成的危險(xiǎn)因素。Pathak等[15]綜合21篇病例對(duì)照研究的流行病學(xué)的Meta分析中提出，對(duì)于曾經(jīng)罹患過隱睪的患者，患有睪丸癌的OR值從3.5～17.1，總的相對(duì)危險(xiǎn)度為4.8(4.0～5.7)。雖然有幾種發(fā)病機(jī)制用于解釋隱睪，但在大多數(shù)病例，隱睪癥的原因尚不清楚[16]。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)疾病有家族聚集性，隱睪癥家族史是隱睪癥的危險(xiǎn)因素。初步研究發(fā)現(xiàn)6.2%隱睪患者的兄弟和1.5%～4.0%的隱睪患者的父親患有隱睪癥[17-19]。綜上所述，遺傳因素可能對(duì)隱睪癥的發(fā)展起一個(gè)至關(guān)重要的作用。

Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的細(xì)胞的增殖、分化、形態(tài)和運(yùn)動(dòng)[8]，多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)Wnt信號(hào)通路在小鼠胚胎和出生后的發(fā)育和疾病的重要性[5,12,20-22]，并有研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路的激活可能與隱睪發(fā)病相關(guān)[9]。Axin1是野生型Axin基因，該通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。廣泛表達(dá)的Axin1參與了胚胎神經(jīng)軸的形成[23-26]?？傊?，Axin1可能在隱睪的發(fā)展中扮演做一種重要的角色。在選擇的Axin1 3個(gè)標(biāo)簽SNPs中，兩個(gè)SNPs位于內(nèi)含子區(qū)，另1個(gè)SNP位于同義密碼子區(qū)域。證據(jù)研究表明內(nèi)含子和其他非蛋白編碼RNA在高等生物中可能作為網(wǎng)絡(luò)控制分子，使得這些生物從一個(gè)簡(jiǎn)單的單輸出蛋白遺傳操作系統(tǒng)的限制中釋放出來(lái)[27]。因此，標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性可能會(huì)作為控制區(qū)去影響其他基因的傳導(dǎo)影響其他基因的行為，而不是通過影響氨基酸的翻譯去影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu).

實(shí)驗(yàn)研究了Axin1基因的遺傳變異對(duì)隱睪的影響，并且觀察到隱睪患者和對(duì)照組的Axin1基因SNPs的等位基因和基因型頻率變化具有顯著差異，為Axin1基因的rs370681基因多態(tài)的T/T基因型和rs1805105基因多態(tài)的C/T基因型在隱睪患者中的頻率更高提供了重要的證據(jù)。結(jié)果提示這些等位基因和基因型可能是隱睪發(fā)展的危險(xiǎn)因素。