白樺BpERF1和BpERF2基因的克隆與表達(dá)模式分析

趙雅彬，張 博，胡 林，袁 浩，朱俊勇，孫麗芳，張文慧

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

AP2/ERF（APETALA2/ethylene responsive element binding factor）家族轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)植物生物和非生物逆境反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1-2]。在秈稻和粳稻基因組中分別鑒定出170和189個AP2/ERF家族基因，在擬南芥中共鑒定出176個[3]。目前，已報道的多數(shù)ERF家族成員被干旱、鹽堿、低溫、病害、機械損傷等逆境或乙烯（ET）、脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）等內(nèi)源激素所誘導(dǎo)，參與不同信號途徑的調(diào)控。Xu Z.S.等[4]提出了植物在高鹽、干旱、低溫、病害及蟲害脅迫下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；Song X.M.等[5]在AP2/ERF家族鑒定出214個白菜和擬南芥的同源基因，并且構(gòu)建了這些同源基因互作的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)7個CBF基因和4個AP2基因參與冷脅迫誘導(dǎo)的調(diào)控途徑；大麥HvRAF基因被乙烯、水楊酸、茉莉酸甲酯、高鹽和病害所誘導(dǎo)[6]；水稻OsEBP-89基因可以被高鹽和2，4-D脅迫所誘導(dǎo)[7]；番茄TSRF1基因的表達(dá)受乙烯、水楊酸及病害的誘導(dǎo)[8]。

ERF轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物學(xué)過程，如次生代謝，根、花、種子的發(fā)育，尤其是ERF基因具有抗逆能力并調(diào)控多種抗逆途徑[9-12]。Xu Z.等[13]從小麥中分離出TaERF1基因，該基因可以被鹽、干旱、低溫及ABA等誘導(dǎo)表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)過表達(dá)該基因可以激活PR、COR/RD等抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，同時提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆能力；Jin L.等[14]從棉花中克隆到GhERF4基因，該基因可以被乙烯、鹽、干旱及冷脅迫所誘導(dǎo)，對該基因的啟動子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中有一些可以被逆境脅迫誘導(dǎo)的順式作用元件，表明該基因可以被乙烯、ABA及逆境脅迫所誘導(dǎo)參與并調(diào)控多種抗逆途徑；擬南芥AtERF71/HRE2基因可以被NaCl、甘露醇以及ABA顯著誘導(dǎo)，過量表達(dá)AtERF71/HRE2基因的擬南芥植株與對照相比耐鹽及耐旱能力增強而且在鹽脅迫下ROS水平也低于對照植株[15]；辣椒的CaAIEF1基因可以提高辣椒對ABA及干旱的抗性[16]；野生大豆GsERF71基因可以提高擬南芥植株的耐堿性[17]。

目前，關(guān)于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式和功能解析在某些作物中已有報道，如擬南芥、煙草、水稻、大豆等，但是在木本植物中的研究相對薄弱，如Yao W.J.等[18]研究了小黑楊ERF基因在多種非生物脅迫下的表達(dá)；過量表達(dá)楊樹ERF76基因可以提高煙草對鹽脅迫的抗性[19]；對桑樹VIIERF基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)分析[20]。對白樺ERF基因的研究則鮮有報道，目前只有Zhang W.H.等[21]研究了白樺BpERF11基因?qū)}和干旱脅迫的抗性。白樺（Betula platyphylla）為樺木科樺屬植物，為落葉喬木，生長速度快、耐寒能力強，是我國北方地區(qū)重要的森林天然更新樹種，特別是近年來，白樺因其樹型、葉形葉色和樹皮等方面的觀賞價值，也成為北方城市園林綠化的重要景觀樹種。因此，發(fā)掘白樺ERF基因并對基因的抗逆能力進(jìn)行鑒定和驗證可以為白樺的抗逆分子育種提供理論依據(jù)。本實驗從白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找到2條ERF基因，并對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析及在脅迫下的表達(dá)模式分析，為白樺抗逆育種提供重要基因源和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及處理

本實驗所用材料為野生白樺種子。將野生白樺種子均勻撒播于黑土、蛭石、珍珠巖3∶2∶1的基質(zhì)中。培養(yǎng)于平均溫度為24℃、相對濕度為70%～75%、光照周期為14 h光照/10 h黑暗的溫室中。將出苗2個月左右的幼苗分別用200 mmol/L NaCl和20%PEG-6000進(jìn)行根部脅迫處理，分別在 3、6、12、24和48 h對根、莖、葉進(jìn)行取樣，在液氮中速凍后于-80℃冰箱中保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 白樺RNA的提取及cDNA的合成

通過CTAB法提取植物的總RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒，操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 白樺ERF基因的生物信息學(xué)分析

從白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中選出2條ERF家族基因，進(jìn)行序列比對并用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）確定 2個白樺ERF基因的完整開放閱讀框，命名為BpERF1（Genbank ID：KM980445）和 BpERF2（Genbank ID：KM980446）；對BpERF1和BpERF2基因進(jìn)行克隆，所用引物見表1；使用在線工具pI/Mw（http：//web.ex pasy.org/protparam/）分析編碼蛋白的相對分子質(zhì)量、等電點等理化性質(zhì)；使用在線軟件NLStradamus（http：//www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/）預(yù)測蛋白的核定位信號；使用在線軟件NCBI Conserved Domain Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；使用Bioedit軟件進(jìn)行多重序列比對；系統(tǒng)進(jìn)化樹用MEGA 6.0軟件構(gòu)建；使用 SWISS MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）在線程序進(jìn)行蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.3 RT-PCR分析

RT-PCR分析所用引物通過NCBI網(wǎng)站的Primer Blast工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blas）進(jìn)行設(shè)計，內(nèi)參基因為白樺Tubulin和Ubiquitin基因，以脅迫處理的白樺根、莖、葉組織的cDNA為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR分析，每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)和3次平行樣重復(fù)。20 μL反應(yīng)體系：10 μL 熒光染料、2 μL cDNA、1 μL 混合引物、7 μL H2O。反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 12 s，58 ℃30 s，72 ℃ 45 s，40 個循環(huán)?；虻谋磉_(dá)量采用 2-ΔΔCt法計算，相對表達(dá)量用log2轉(zhuǎn)換[22]。反應(yīng)所需引物見表2。

表1 克隆BpERF1和BpERF2基因所用引物Table1 primers used for PCR amplification of BpERF1 and BpERF2 genes

表2 RT-PCR分析所用引物序列Table2 Primers used for real time RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 ERF基因的cDNA序列分析

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明BpERF1和BpERF2基因的cDNA序列長度分別為939 bp和687 bp（見圖1），分別編碼312和228個氨基酸；預(yù)測蛋白分子量分別為76.75和55.94 kD，等電點分別為5.05和5.11。核定位信號預(yù)測結(jié)果顯示BpERF2基因含有2個核定位信號，BpERF2基因含有1個核定位信號。

圖1 BpERF1和BpERF2基因PCR產(chǎn)物電泳檢測Figure1 Electrophoresis detection of PCR products of BpERF1 and BpERF2 genes

通過NCBI網(wǎng)站的Blast工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比較BpERF1和BpERF2基因的序列相似性，如圖2所示，兩個基因的同源性為43%。

2.2 ERF基因的蛋白序列分析

搜索SMART網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析，結(jié)果顯示BpERF1和BpERF2這兩個蛋白均含有1個典型的由60個氨基酸組成的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域。將這2個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域提交到SWISS MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）在線程序，BpERF1 和 BpERF2 分別以 AtERF1（PDBID：3gcc.1.A）和 AtERF1（PDBID：1gcc.1.C）分子模型為基礎(chǔ)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示這兩個結(jié)構(gòu)域均含有3個反向平行的β折疊和一個α螺旋，2條蛋白的保守結(jié)構(gòu)域相似（見圖3）。

2.3 ERF基因的同源性及進(jìn)化分析

2.3.1 ERF基因保守結(jié)構(gòu)域的同源性比對

在Tair數(shù)據(jù)庫查找22條擬南芥ERF基因，借助NCBI數(shù)據(jù)庫軟件確定2條白樺和21條擬南芥ERF基因的保守序列，并使用Bioedit軟件對23條ERF基因的保守序列進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果如圖4所示。

多序列比對結(jié)果顯示，白樺BpERF1和BpERF2基因的保守序列與擬南芥的ERF家族基因的保守序列都具有1個AP2保守結(jié)構(gòu)域，說明他們都屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中的ERF家族，并且白樺和擬南芥ERF基因的保守結(jié)構(gòu)域具有較高的同源性，它們的β折疊和α螺旋結(jié)構(gòu)序列見圖4。白樺BpERF1和BpERF2基因保守序列的14和19位氨基酸相同，都是丙氨酸（A）和天冬氨酸（D），這與擬南芥的 AT4G11140.1、AT4G23750.1、AT1G68550.1等基因是一致的，說明他們屬于ERF家族的ERF亞家族，而保守序列的14和19位氨基酸為纈氨酸（V）和谷氨酸（E）的基因如擬南芥的AT1G46768.1、AT2G23340.1、AT5G52020.1等基因則屬于ERF家族的DREB亞家族成員。

圖2 BpERF1和BpERF2基因的序列相似性分析Figure2 Sequence similarity analysis of BpERF1 and BpERF2 genes

圖3 BpERF1和BpERF2蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型Figure3 Tertiary structure models predicted of BpERF1 and BpERF2 proteins

圖4 白樺和擬南芥ERF基因保守結(jié)構(gòu)域的同源性比對Figure4 Conserved domain homology alignment of white birch and arabidopsis ERF genes

2.3.2 ERF蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

以擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的分類為基礎(chǔ)[23]，利用MEGA7.0軟件對BpERF1、BpERF2蛋白和擬南芥、水稻、大豆、油桐、蘋果、李、櫻桃的ERF蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹（見圖5）。結(jié)果表明，BpERF1和BpERF2都屬于ERF亞家族成員，BpERF1屬于B-2組，與蘋果的NM_001320016.1蛋白親緣關(guān)系最近，BpERF2屬于B-4組，與油桐的KX868935.1蛋白親緣關(guān)系最近，對于蘋果的NM_001320016.1和油桐的KX868935.1基因功能尚未有研究報道。

2.4 白樺ERF基因的表達(dá)分析

通過RT-PCR對鹽和干旱脅迫下白樺BpERF1和BpERF2基因在根、莖、葉中的表達(dá)量進(jìn)行檢測，如圖6所示。

在NaCl脅迫下，BpERF1和BpERF2基因在根、莖、葉中的表達(dá)模式存在差異。BpERF1基因在根中的相對表達(dá)量與對照相比呈上調(diào)表達(dá)的趨勢，并且在48 h的變化趨勢為先增加后降低，在12 h相對表達(dá)量最低，隨后又呈現(xiàn)上升趨勢，在脅迫48 h時相對表達(dá)量最高，為對照的22.15倍。BpERF2基因在根中的表達(dá)與對照相比呈下調(diào)表達(dá)的趨勢，只有在12 h時相對表達(dá)量高于對照，其余時間點表達(dá)量均低于對照。BpERF1基因在莖中的相對表達(dá)量呈上

調(diào)表達(dá)趨勢，但表達(dá)量明顯低于根，各時間點的相對表達(dá)量變化不大。BpERF2基因在莖中完全呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢，相對表達(dá)量最低的是6 h，只有對照表達(dá)量的0.08倍。BpERF1基因在葉中的相對表達(dá)量也呈上調(diào)表達(dá)趨勢，表達(dá)量介于根和莖的表達(dá)量之間，最高相對表達(dá)量出現(xiàn)在脅迫48 h，表達(dá)量為對照的3.97倍。BpERF2基因在葉中依然呈下調(diào)表達(dá)的趨勢，只有在24 h時相對表達(dá)量高于對照（見圖6）。

圖5 白樺和其他植物ERF基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Figure5 Phylogenetic analysis of white birch with other ERF genes

圖6 NaCl和干旱脅迫下白樺BpERF1和BpERF2基因在根、莖、葉中的表達(dá)模式分析Figure6 Expression pattern of BpERF1 and BpERF2 genes in roots，stems and leaves under NaCl and PEG stress

在PEG脅迫下，BpERF1基因在根中的表達(dá)與對照相比呈上調(diào)表達(dá)的趨勢，并且在48 h的相對表達(dá)量最高，為對照的6.84倍。BpERF2基因在根中的表達(dá)與對照相比呈下調(diào)表達(dá)的趨勢，在6 h的相對表達(dá)量最低，只有對照的0.05倍。BpERF1和BpERF2基因在莖中的相對表達(dá)量均呈下調(diào)表達(dá)趨勢，但BpERF2基因表達(dá)量明顯低于BpERF1基因，BpERF2基因在48 h的相對表達(dá)量僅為對照的0.01倍。BpERF1基因在葉中的表達(dá)呈現(xiàn)出先下調(diào)表達(dá)后上調(diào)表達(dá)的趨勢，BpERF2基因在葉中依然呈下調(diào)表達(dá)的趨勢，在6 h時相對表達(dá)量達(dá)到最低（見圖6）。

3 討論與結(jié)論

通過序列比對發(fā)現(xiàn)白樺的BpERF1和BpERF2基因?qū)儆贓RF家族的ERF亞家族，ERF亞家族成員可以識別GCC盒（AGCCGCC），在植物抵抗生物脅迫過程中發(fā)揮重要的作用[24]。BpERF1和BpERF2均含有1～2個核定位信號，這與前人的結(jié)果一致，說明ERF蛋白在細(xì)胞核中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。BpERF1基因?qū)儆贐-2組，擬南芥的B-2組共包含5個ERF基因，分別是 At2g47520（AtERF71）、At3g16770（AtERF72）、At1g72360（AtERF73）、At21g53910（AtE RF74）、At3g14230（AtERF75），研究發(fā)現(xiàn)該組基因?qū)χ参锏牟『Α⒌脱跫皾B透脅迫具有調(diào)控作用[15，25-26]。BpERF2基因?qū)儆贐-4組，擬南芥的B-4組共有8個ERF基因（AtERF108-AtERF115），目前對它們的功能研究較少，Zhu Q.的研究結(jié)果[27]表明RAP2.6（AtERF108）應(yīng)答ABA、鹽和干旱脅迫。與BpERF1和BpERF2基因同源性最高的蘋果NM_001320016.1基因和油桐KX868935.1基因功能則未有報道。前人的研究結(jié)果表明ERF轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物學(xué)過程，尤其是具有抗逆能力并調(diào)控多種抗逆途徑，但是對白樺ERF基因的研究則很少，目前只有Zhang W.H.等[21]研究了白樺BpERF11基因的抗鹽耐旱功能，BpERF11基因可以通過調(diào)控SOD、POD、LEA等防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)對高鹽和干旱脅迫起負(fù)調(diào)控的作用。BpERF1、BpERF2和BpERF11基因都可以被高鹽和干旱脅迫所誘導(dǎo)，但表達(dá)模式上有所差異，BpERF11基因在脅迫下呈上調(diào)表達(dá)趨勢，而BpERF1和BpERF2基因在莖和葉中多數(shù)表達(dá)量很低或呈下調(diào)表達(dá)趨勢，說明BpERF1和BpERF2基因可能與BpERF11基因參與不同的調(diào)控途徑來調(diào)控逆境脅迫；BpERF11蛋白保守序列的14和19位氨基酸為纈氨酸（V）和谷氨酸（E），屬于DREB亞家族A-5組，而BpERF1和BpERF2蛋白保守序列的14和19位氨基酸相同，都是丙氨酸（A）和天冬氨酸（D），分別屬于ERF亞家族的B-2和B-4組，前人的研究結(jié)果表明位于第2個β折疊中的第14、19位的2個氨基酸殘基的差異，決定這類轉(zhuǎn)錄因子與不同的順式作用元件的特異結(jié)合，BpERF11基因可以和G-box和DRE元件結(jié)合，而BpERF1和BpERF2基因可以與哪些元件結(jié)合需要通過進(jìn)一步實驗證明[28]。根據(jù)以上的研究結(jié)果推測BpERF1和BpERF2基因參與植物對生物和非生物脅迫的應(yīng)答，但參與的逆境調(diào)控途徑可能與BpERF11基因不同。

本試驗對白樺的BpERF1和BpERF2基因在高鹽和干旱脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個ERF基因均可以不同程度地被高鹽和干旱脅迫所誘導(dǎo)，但不同ERF基因在脅迫下的表達(dá)模式存在差異，比如，BpERF1基因在NaCl脅迫下與對照相比呈上調(diào)表達(dá)趨勢，而BpERF2基因的表達(dá)量則低于對照；并且ERF基因的表達(dá)具有組織特異性，比如，在NaCl脅迫下BpERF1基因在根和葉中呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)，但在莖中表達(dá)量則和對照沒有明顯差異，而在PEG脅迫下BpERF2基因在根、莖和葉中均呈現(xiàn)出明顯的下調(diào)表達(dá)趨勢。前人的研究結(jié)果表明水稻的OsAP25基因在NaCl脅迫下表達(dá)量明顯上升[29]。M.K.Sharma 等[30]發(fā)現(xiàn)在 NaCl脅迫下 SlERF9、16、26、30、68和 80基因被高度誘導(dǎo)表達(dá)，而基因SlERF 4、5、14、21、50、51 和 73 則呈下調(diào)表達(dá)趨勢，本實驗與前人的研究結(jié)果一致，說明脅迫條件下不同ERF基因的表達(dá)具有時間與空間的特異性。BpERF1和BpERF2基因在脅迫下的表達(dá)模式不同，說明它們可能通過不同的調(diào)控機制來應(yīng)答逆境脅迫，具有進(jìn)一步研究的價值。