廣東豬群新發(fā)非典型瘟病毒病的診斷和病毒鑒定

賀東生，殷三鴻，石 堅(jiān)， 李錦輝 ，蘇丹萍，周 霞，劉博聞

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523000）

非典型豬瘟病毒是區(qū)別于豬瘟的一種新型病毒，最近3年國(guó)外才開始報(bào)道。該病臨床癥狀表現(xiàn)為新生仔豬，以四肢、頭部或全身出現(xiàn)有節(jié)奏的震顫，發(fā)病率和致死率較高，并具有傳染性[1]。

2015年，Hause 等從病豬中擴(kuò)增到一種新的病毒全基因組，與CSFV、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）和邊界病毒（BDV）等瘟病毒基因組的同源性很低（65%以下），證實(shí)了豬非典型瘟病毒是一種新型、高度分化的豬瘟病毒，廣泛分布于美國(guó)豬體內(nèi)[2]，之后德國(guó)、荷蘭、奧地利、巴西等多個(gè)國(guó)家先后發(fā)現(xiàn)豬群存在 APPV 流行[3，7-13]。我國(guó)對(duì)該病僅有少量報(bào)道[1，6-7]

近年來，隨著規(guī)?；?、集約化養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)發(fā)展，非典型性豬瘟（APPV）可能給養(yǎng)殖業(yè)帶來潛在的重大經(jīng)濟(jì)損失。目前在國(guó)內(nèi)該病尚缺乏快速有效地診斷方法和防控手段。本文是在華南地區(qū)首次報(bào)道該病并對(duì)診斷方法和病毒遺傳變異進(jìn)行了系統(tǒng)研究，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

本研究檢測(cè)的47份豬病料（腦、心、肝、脾、肺、腎和淋巴結(jié)）于2017-2018年采自廣東和華南地區(qū)多個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的發(fā)病新生仔豬和保育豬，病豬臨床表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、全身震顫、慢性消瘦、喘氣、哺乳困難、精神萎靡。病理剖檢觀察為多器官衰竭，淋巴結(jié)腫大并伴有出血癥狀，疑似為APPV感染。收集病料低溫凍存后，送本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)無菌處理保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

DNA MarkerDL2000、dNTP、Taq 酶等購自大連寶生物；pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA公司；RNA提取試劑盒購自康寧公司；PrimeS-criptTMone Step RT-PCR Kit ver.2購自TaKaRa公司；引物合成由北京睿博興科公司完成；DNA測(cè)序由華大基因公司完成。

表1 APPV及CSFV引物序列

1.1.3 培養(yǎng)基

氨芐青霉素(100 mg/mL)、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基，LB選擇培養(yǎng)基等按常規(guī)方法配制。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將待檢病料按照1：3加入PBS緩沖液進(jìn)行稀釋研磨，-20 ℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心15 min后取上清液，用0.22 μm的微孔過濾器過濾除菌，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒總RNA的提取

按 RNA提取試劑盒說明書提取病毒核酸，然后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成

本實(shí)驗(yàn)室根據(jù) GeneBank 所發(fā)布的序列號(hào)，選擇全基因序列，運(yùn)用 Primer Premier5.0 針對(duì) E2基因設(shè)計(jì) 1 對(duì) APPV引物。其中，CSFV E2基因引物為本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)。由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.4 A P P V/C N/H U ANAN/201801 E2基因的PCR擴(kuò)增

以病毒RNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×1step Buffer 10μL，RNase Free dH2O 5.6μL，上 下 游 引 物 各 0.5μL，DNA模板 3μL，Prime Script 1 step Enzyme Mix 0.4μL。PCR 擴(kuò) 增 程 序?yàn)?：50 ℃反轉(zhuǎn)錄 30 min ；94 ℃預(yù)變性 5 min ；94 ℃ 變 性 30 s；59 ℃ 退 火30 s ；72 ℃ 延 伸 1 min 30 s ；35 個(gè) 循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，CLINX凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.2.5 基因的克隆和測(cè)序

將陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與 PMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含氨芐青霉素(100 mg/mL)LB平板，37 ℃培養(yǎng)后挑單個(gè)菌落接種含氨芐青霉素(100 mg/mL)LB液體培養(yǎng)基，37 ℃下150 r/min搖菌培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行鑒定，鑒定成功的重組質(zhì)粒送往華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 基因序列分析

將PCR擴(kuò)增獲得的基因片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，利用 DNA Star和MEGA7軟件處理，與GeneBank上已公布的17株APPV參考毒株(表2)和10株CSFV參考毒株（表3）的基因序列進(jìn)行E2基因同源性比對(duì)及遺傳變異分析。

表2 Genebank已登錄的APPV參考毒株

表3 Genebank已登錄的CSFV參考毒株

2 結(jié)果與分析

2.1 病料PCR 檢測(cè)結(jié)果

以提取的RNA為模板，用CSFV和APPV引物分別對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果所示（圖1），CSFV檢測(cè)結(jié)果為陰性，APPV在1 408 bp左右有明顯條帶，檢測(cè)結(jié)果為陽性。由此說明該病毒為APPV而非CSFV。將 APPV PCR產(chǎn)物純化后構(gòu)建至pMD-19T質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序，成功克隆了該病毒的目標(biāo)序列，并獲得 E2 段基因序列，序列長(zhǎng)度為723 bp。

圖1 APPV/CN/HUANAN/201801 E2 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 APPV/CN/HUANAN/201801 E2基因的序列同源性分析

APPV 基因組ORF 區(qū)編碼蛋白 由 Npro、C、Erns、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B 組成。在結(jié)構(gòu)蛋白中，E2 是 APPV主要的保護(hù)性抗原蛋白。將APPV/CN/HUANAN/201801株E2基因測(cè)序結(jié)果在GeneBank已登錄的17株APPV參考毒株（表2）與10株CSFV參考毒株（表3）進(jìn)行E2基因的序列對(duì)比和同源性比較，用DNA Star進(jìn)行同源性分析(圖2)， 結(jié) 果 表 明，APPV/CN/HUANAN/201801 E2基因與GeneBank上已公布的APPV參考毒株核苷酸序列同源性為81.3%～96.4%：其中與中國(guó)已公布毒株相比，核苷酸同源性為82.3%～96.4%；與美國(guó)毒株相比核苷酸同源性為81.3%～85.4%；與奧地利毒株相比核苷酸同源性為84.6%；與德國(guó)毒株相比核苷酸同源性為84.3%～86.9%；與荷蘭毒株相比核苷酸同源性為86.5%。該毒株與中國(guó)GD1株同源性最高，為96.4%；與美國(guó)000515株同源性最低，為81.3%。與GeneBank上已公布的CSFV參考毒株核苷酸序列同源性為39.0%～41.1%。

圖2 基于 APPV/CN/HUANAN/201801 E2基因的序列同源性分析

圖3 基于APPV/CN/HUANAN/201801 E2基因的遺傳進(jìn)化樹

2.3 基于 APPV/CN/HUANAN/201801株E2基因的遺傳進(jìn)化分析

以 表2中17株APPV毒 株和10株CSFV毒株為參考，運(yùn)用 MEGA7.0 軟 件 采 用 Neighbor-Joining 聚類分析方法構(gòu)建基于E2基因序列的進(jìn)化樹(圖3)。APPV/CN/HUANAN/201801 E2 與中國(guó)毒株親緣關(guān)系較近，而與美國(guó)、奧地利、德國(guó)、荷蘭毒株較遠(yuǎn)。本次鑒定毒株與國(guó)內(nèi)其他毒株雖然親緣關(guān)系較近，但單獨(dú)形成一個(gè)分支，說明該病毒是APPV新成員。

3 討論

近幾年來，非典型瘟病毒（APPV）感染的發(fā)病率、致死率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，給養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。本次鑒定出的 APPV/CN/HUANAN/201801株與其他毒株不在一個(gè)分支，表明在進(jìn)化過程中高度變異，這種變異給疾病的防控、檢測(cè)以及疫苗的研制增加了難度。為了進(jìn)一步證實(shí)APPV的致病性，我們進(jìn)行了病毒分離。豬腎細(xì)胞系（PK15），豬睪丸細(xì)胞系（ST），豬原代淋巴細(xì)胞系和豬原代脾細(xì)胞系均能檢測(cè)到該病毒的復(fù)制。Schwarz（2017)報(bào)道APPV可以在不同的豬細(xì)胞上分離和傳代，但滴度非常低[8]，病毒的持續(xù)傳代培養(yǎng)仍未取得突破性進(jìn)展。該病毒是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型瘟病毒，國(guó)內(nèi)外對(duì)該病尚未開展全面的研究。由于發(fā)病率高、死亡率高、潛在損失大，需要進(jìn)一步加強(qiáng)其生物學(xué)特性以及致病性研究，提供防控預(yù)案，減少養(yǎng)殖損失。

致謝：本實(shí)驗(yàn)是在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院、人獸共患病防控制劑國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和廣東省獸用生物制品技術(shù)研究與應(yīng)用企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝廣東省生豬產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金的資助。