表面增強拉曼光譜法測定鴨肉中氧氟沙星殘留

李 耀， 劉木華， 袁海超， 趙進輝

(江西農業(yè)大學工學院/生物光電及應用重點實驗室，江西南昌 330045)

表面增強拉曼光譜法(Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)[1-3]是一種具有高靈敏度、高分辨率、受水干擾小等特點的光譜檢測方法，其對吸附在金、銀或銅等膠質金屬顆粒表面上的分子的拉曼光譜有很強的增強效果。SERS技術在生物醫(yī)學、化學、環(huán)境、食品安全等領域得到了廣泛應用，在抗生素殘留檢測方面也有相關的研究報道。XIE等[4]采用SERS技術快速測定和鑒定呋喃丹啶和呋喃它酮及其混合物，研究結果表明金納米粒子增強SERS法識別和表征呋喃丹啶和呋喃它酮是可行的。吉薇[5]采用金納米溶膠增強SERS來檢測肉類和牛奶中氯霉素及其琥珀酸鈉的殘留，獲得了較好的效果。Zhao等[6]采用SERS技術進行了豬肉中萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅殘留量檢測與識別研究。

氧氟沙星(Ofloxacin，OFX)作為一種具有較好殺菌效果的第三代喹諾酮類廣譜抗生素，在鴨養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用。但對OFX的不合理使用很容易造成OFX在鴨體內殘留超標，進而影響人體健康。雖然高效液相色譜、液-質聯(lián)用等方法可用于鴨肉中OFX殘留檢測，但檢測過程復雜耗時。因此，研究一種鴨肉中的OFX殘留的快速檢測方法非常必要。有學者應用SERS技術對左氧氟沙星水溶液進行定性定量分析[ 7]，但還未見鴨肉中OFX殘留檢測的SERS研究報道。本研究以自制金納米顆粒作為增強試劑，建立了一種鴨肉中OFX殘留的SERS快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

OFX標準品(純度為99.0%，南昌精科科學儀器有限公司)溶液:用乙酸乙酯將10 mg OFX標準品溶于100 mL棕色容量瓶中，超聲溶解后定容到刻度線，得到100 mg/L的OFX標準溶液。不同濃度的OFX標準溶液用乙酸乙酯稀釋可得。HAuCl4·3H2O(Sigma-Aldrich)；檸檬酸三鈉、乙酸乙酯均為分析純(汕頭西隴化工股份有限公司)；無水Na2SO4、NaCl(天津市永大化學試劑有限公司)。實驗室自制超純水作為本研究實驗用水。

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1.2 儀器設備

海洋光學有限公司生產的QE65000便攜式拉曼光譜儀；北京普析通用儀器責任有限公司生產的T6新世紀紫外-可見分光光度計；湖南科爾頓水務有限公司生產的T10型實驗室超純水機；北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司生產的DL-1電子萬用爐；江蘇省金壇市金南儀器廠生產的JJ-2B型組織搗碎勻漿機；合肥金尼克機械有限公司生產的JK-50B 型超聲波清洗器；上海上平儀器有限公司生產的FA1004B型電子天平；海門市其林貝爾儀器有限公司生產的VORTEX-5漩渦混合器；安徽嘉文儀器裝備有限公司生產的JW-1024低速離心機；北京成騰器材有限公司生產的石英進樣瓶；石英比色皿(1 cm光程)。

1.3 實驗方法

參照文獻方法[8]制備金膠納米粒子：將2 mL HAuCl4(1%)置于500 mL燒杯中，加超純水定容到200 mL。用電子萬用爐將其加熱至沸騰后，加1 mL檸檬酸三鈉(1%)，繼續(xù)加熱約8 min直至溶液顏色變紫紅色后，冷卻至室溫，4 ℃保存。

用組織搗碎機將鴨胸脯肉搗碎充分均勻后，密封后在-18 ℃下保存。將5 g搗碎的鴨胸脯肉和6.5 g無水Na2SO4置于50 mL離心管中，然后加入15 mL乙酸乙酯并渦旋1 min，超聲振蕩10 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液。重復提取一次，并合并兩次提取的上清液，然后用快速濾紙過濾得到所需的鴨肉提取液。稱取5 mg的OFX標準品溶于一定體積的鴨肉提取液中，超聲溶解后定容到刻度線，得到含100 mg/L OFX的鴨肉提取液加標樣本。再將其依次稀釋可得含不同濃度OFX的鴨肉提取液加標樣本。

向2 mL的石英進樣瓶中依次加入500 μL金膠、10 μL含不同濃度OFX的鴨肉提取液加標樣本和120 μL NaCl溶液(0.1 mol/L)，混合均勻后放入樣本池中進行SERS光譜采集。儀器參數(shù)設置如下：光譜儀激光功率400 mW，激光波長785 nm，積分時間10 s，積分平均2次，并選擇400～ 1 800 cm-1波段范圍的拉曼光譜進行研究。

對金膠加入量、待測液樣本加入量、NaCl溶液加入量及吸附時間分別進行單因素分析，以確定最佳的實驗條件。在最佳的條件下，采集樣本的SERS光譜，且熒光等背景信號采用自適應迭代懲罰最小二乘法算法(air-PLS)扣除。其中，所有樣本的光譜均采集3次，并在數(shù)據分析中采用3次測量的平均值作為樣本的SERS光譜。

2 結果與分析

2.1 紫外-可見吸收光譜

圖1 紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectrum(a) Gold colloid;(b) Gold colloid+duck meat extract containing OFX (5 mg/L)+NaCl.

本研究選用1 mL超純水稀釋500 μL金膠作為樣本1；將500 μL金膠、10 μL含OFX的鴨肉提取液加標樣本(5 mg/L)與120 μL NaCl溶液混合，再加入1 mL超純水稀釋作為樣本2，采集這兩個樣本的紫外-可見吸收光譜，其紫外-可見吸收光譜曲線分別見圖1中曲線a、b所示。由曲線a可觀察到，金膠的最大吸收峰約在538 nm處，半峰寬約66 nm。由曲線b可以看出，金膠、含OFX的鴨肉提取液和NaCl溶液的混合液最大吸收峰為544 nm，相比金膠的吸收峰發(fā)生了6 nm的紅移，峰形也顯得更寬。該現(xiàn)象表明，由于OFX分子與金膠納米粒子表面發(fā)生吸附或結合，使得金膠納米粒子表面的等離子共振性質發(fā)生了改變，進而影響了金納米粒子的大小或聚集狀態(tài)[9]。

2.2 鴨肉中OFX的SERS分析

圖2 (a) 鴨肉提取液的SERS；(b) 乙酸乙酯的SERS；(c) 鴨肉提取液加標樣本的普通拉曼光譜(5 mg/L)；(d) OFX標準品的SERS(5 mg/L)；(e) 含OFX的鴨肉提取液加標樣本的SERS(5 mg/L)Fig.2 (a) SERS of duck meat extract；(b) SERS of ethyl acetate；(c) Normal Raman spectrum of duck meat extract containing OFX (5 mg/L)；(d) SERS of OFX solution(5mg/L)；(e) SERS of duck meat extract containing OFX (5 mg/L)

分別采集鴨肉提取液樣本、乙酸乙酯的SERS及含OFX的鴨肉提取液加標樣本的普通拉曼光譜，OFX標準品的SERS和含OFX的鴨肉提取液加標樣本的SERS，其光譜曲線如圖2所示。對比圖中曲線b與曲線d可知，在曲線d中1 123、1 307、1 399、1 492和1 597 cm-1處出現(xiàn)明顯很高的峰值且較為穩(wěn)定，而在曲線b上這幾處位置均無拉曼峰，并且在曲線d上1 307 cm-1處所得峰值是上述幾處拉曼峰中最高的，由此考慮將此處特征峰作為檢測OFX的拉曼特征峰。同時，對比曲線d、e與曲線a，在含OFX的鴨肉提取液的SERS曲線e中，觀察到在上述幾個明顯較高峰值處也能得到與曲線d類似的峰譜，而且在1 307 cm-1處所得峰值也為最高。但在鴨肉提取液的SERS曲線a中無法得到相關譜峰。從上述分析確定以1 307 cm-1處的峰值可作為本研究中OFX檢測的最佳特征峰，后期實驗均以此處峰值作為OFX的定性定量考察依據。將曲線c和曲線e對比可知，含OFX鴨肉提取液的拉曼光譜所得到的譜峰單一，且強度不高，不利于對OFX的考察；不過在加入金膠和NaCl溶液后所測得的含OFX鴨肉提取液的SERS光譜，具有峰值明顯且較多的特點，這也證明了金膠和NaCl溶液對加標樣本的拉曼峰有較好的增強效果。

2.3 金膠加入量對SERS信號的影響

分別將不同體積的膠體(200、300、500、700、900 μL)加入10 μL含5 mg/L OFX的鴨肉提取液樣本和120 μL NaCl溶液混合，然后采集它們的SERS光譜數(shù)據。分析所得到的SERS光譜曲線，當膠體加入量為500 μL時，1 307 cm-1特征峰處的強度達到最高，而且相比其他加入量所測得的SERS光譜曲線更為清晰，峰值更加明顯。研究結果顯示，特征峰的強度隨著膠體加入量增加，它呈現(xiàn)為先增再減的趨勢，當金膠加入量在500 μL時所得峰強可達到最高。由此確定，金膠的最佳加入量為500 μL。

2.4 待測液樣本加入量對SERS信號的影響

由于待測液中的OFX分子與金膠納米粒子發(fā)生了表面等離子體共振而產生表面增強拉曼效果。在確定金膠的加入量后，鴨肉提取液加標樣本中OFX分子量的變化會對拉曼光譜增強影響很大。實驗中固定500 μL金膠量，分別加入不同量(5、10、15、20、30 μL)的含5 mg/L OFX的鴨肉提取液加標樣本，再加入120 μL的NaCl溶液，分別采集SERS光譜。分析所得到的SERS光譜曲線，在OFX1 307 cm-1特征峰位置處所測得的峰值在各曲線中均為最高，特別是待測液量為10 μL時的1 307 cm-1處特征峰強度為各曲線光譜強度的峰值。結果表明，待測液加入量的不同對特征峰峰強的影響很大，特征峰1 307 cm-1處峰強在待測液量為5～10 μL時呈上升趨勢，在待測液超過10 μL時所得特征峰峰強相對較低，故本研究實驗中最佳待測液量定為10 μL。

2.5 NaCl溶液加入量對SERS信號的影響

本研究以自制金膠作為表面增強基底，當待測液的分子吸附增強基底后，使膠體出現(xiàn)凝聚，膠體的凝聚程度對SERS效應影響很大[10]。在拉曼光譜檢測中，加入一定濃度的電解質可以對溶膠起誘導和活化作用，改變了待測分子與增強基底的聚集程度，影響了電磁場的增強機理，對SERS信號起到增強的效果[11]。本實驗以NaCl溶液作為膠體的活化劑，來改變納米粒子的團聚效果。金膠加入量500 μL，加入10 μL含5 mg/L OFX的鴨肉提取液加標樣本，再分別加入不同量的NaCl溶液(50、70、100、120、150 μL)，分別采集SERS光譜。結果表明，在NaCl溶液加入量小于120 μL時，所得特征峰峰強是呈逐漸上升的趨勢，這可能是由于金納米顆粒帶負電，一定量的NaCl溶液中的Na+中和金膠納米粒子帶的負電荷，從而增強了OFX分子與金膠納米粒子的凝聚程度，使得拉曼信號得以提升。在NaCl溶液加入量為150 μL時，過量的NaCl分子可能引起了納米粒子的團聚，反而降低了SERS信號的強度。確定NaCl溶液的最佳加入量為120 μL。

2.6 SERS信號受吸附時間的影響

圖3 吸附時間對SERS信號的影響Fig.3 Effect of adsorption time on SERS intensity(a)1 min;(b)5 min;(c)10 min;(d)15 min;(e) 20 min.

研究發(fā)現(xiàn)，樣本與金膠基底吸附反應時間會對所采集到SERS強度存在一定影響。本實驗固定膠體量為500 μL，加入10 μL含5 mg/L OFX的鴨肉提取液加標樣本，再加入120 μL NaCl溶液，分別經過1、5、10、15、20 min后，采集SERS光譜。由圖3可知，在特征峰1 307 cm-1處得到的拉曼光譜強度隨著反應時間的增加逐漸降低。經研究分析，金膠納米粒子與OFX分子吸附反應后發(fā)生一定的聚集，產生活性熱點來決定SERS的增強效果[5]。吸附反應時間的長短對活性熱點影響很大，時間過短時膠體粒子與待測液的分子無法充分吸附，使得光譜信號很弱；吸附時間過長時有可能會使得膠體產生聚沉，也會降低SERS光譜的強度[12]。在本實驗中，選擇OFX分子與金膠納米粒子吸附時間1 min時測試，特征峰處所得的光譜強度可達到最高。故樣本混合1 min時測試得到的SERS增強效果較佳。

2.7 鴨肉中OFX的SERS定量分析

采集不同濃度OFX(0.05、0.1、0.2、0.5、0.7、2.0、4.0、7.0、8.0、10.0和11.0 mg/L)的鴨肉提取液加標樣本的SERS光譜，如圖4所示。以鴨肉中OFX的濃度(x)為橫坐標，拉曼特征峰的峰強(y)為縱坐標，繪制出OFX濃度與各濃度在特征峰1 307 cm-1位置峰強的關系。結果表明，特征峰處所得SERS強度與鴨肉中所含OFX濃度呈良好的線性關系，線性回歸方程為:y=1357.9x+33.737，相關系數(shù)(R2)為0.9946，檢測限為0.05 mg/L。施祖灝等采用高效液相色譜法檢測OFX的檢測限為0.01 mg/L[13 ]，低于本研究采用SERS檢測鴨肉中OFX的檢測限，在后期的研究中，可以通過優(yōu)化前處理方法或選擇增強效果更好的納米粒子來獲取更低的OFX檢測限。

選用不同濃度OFX的鴨肉提取液加標樣本做回收實驗，驗證該方法的可靠性。本研究以OFX含量為1.0、5.0、7.0和9.0 mg/L的鴨肉提取液加標樣本作預測，表1為這4個濃度的預測值和回收率。由表1可知，樣本回收率為89%～106%，這表明用該方法檢測鴨肉中的OFX殘留是可靠的。

表1 鴨肉加標樣本回收率(n=3)

3 結論

本研究測定了鴨肉中的OFX殘留，樣本經過前處理后，利用QE65000便攜式拉曼光譜儀采集樣本的SERS光譜，并最終確定了鴨肉中的OFX殘留檢測的定量分析模型。本方法操作簡單，樣本的前處理時間較短，能夠滿足鴨肉中OFX殘留檢測的要求，具有良好的應用價值。