基于高區(qū)別因子自組裝三臂DNA納米探針檢測(cè)人體多重耐藥基因

許榜田， 楊曉蘭， 白書連， 趙 語*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院，重慶401331；2.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，重慶400016)

癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康，而多重耐藥的產(chǎn)生是腫瘤治療的最大障礙[1,2]。多重耐藥的產(chǎn)生機(jī)制中最常見的是P-糖蛋白(P-gp)的過度表達(dá)。P-gp是由人類多重耐藥(MDR)基因編碼的一種細(xì)胞膜上的Mg2+依賴的ATP酶，其利用ATP水解釋放的能量，通過細(xì)胞膜外排抗腫瘤藥物。雖然大多數(shù)癌癥患者可以通過化療得到緩解，但由于耐藥問題的存在，常導(dǎo)致一些患者化療失敗。其中多重耐藥是主要原因，也是治療白血病最大的難題[3]。此外，MDR基因也可在惡性肉瘤[4]、乳腺癌[5]患者中表達(dá)，且通常是這些患者低生存率的預(yù)警信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)MDR基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)可以改變P-gp蛋白構(gòu)像，造成配體-受體親和力下降。幾種SNPs間可存在較強(qiáng)的連鎖不平衡構(gòu)成單倍型，導(dǎo)致P-gp外排功能減弱[6 - 8]。以上情況均可改變P-gp底物的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)[8]。此外，MDR基因SNPs還與急性淋巴細(xì)胞白血病、癌癥、潰瘍性結(jié)腸炎有關(guān)[9 - 11]。因此，發(fā)展準(zhǔn)確度好、特異性高的針對(duì)MDR基因的檢測(cè)方法在腫瘤早期診斷、耐藥性預(yù)測(cè)和個(gè)體化治療方面有很重要的應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)檢測(cè)MDR基因的方法有RNA印記、免疫印記、流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR等[12 - 14]，盡管這些方法都有效果，但仍然存在一定的缺點(diǎn)，比如耗時(shí)、花費(fèi)高、需要昂貴的儀器。近幾年，研究者報(bào)道了許多核酸檢測(cè)平臺(tái)[15 - 17]，設(shè)計(jì)并優(yōu)化了大量的核酸檢測(cè)探針[18 - 19]。Merko?i等和Liu等報(bào)道了一種基于磁珠的熒光檢測(cè)方法用于檢測(cè)DNA，降低了檢測(cè)成本，提高了反應(yīng)速度和靈敏度[20 - 21]。Hou等報(bào)道了一種基于氮摻雜石墨烯/金納米顆粒的DNA電化學(xué)傳感器，可用于PCR樣本中MDR基因的檢測(cè)，并提高了靈敏度[22]。然而，這些基于核酸探針的實(shí)驗(yàn)最主要的缺陷是缺乏特異性和通用性。Kool等報(bào)道了熒光模板化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)用于RNA的檢測(cè)，雖然提高了檢測(cè)的靈敏度并具有一定的特異性，但需要復(fù)雜的核酸預(yù)處理和化學(xué)連接[23]。Tyagi等人提出的分子信標(biāo)是一種由一條單鏈DNA組成的可在常溫條件下形成頸環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)探針[24]，與單鏈探針相比，分子信標(biāo)雖具有一定特異性，但其設(shè)計(jì)困難且無法檢測(cè)基因組長(zhǎng)片段DNA。因此，迫切需要建立一種新穎的方法實(shí)現(xiàn)特異、準(zhǔn)確并快速地檢測(cè)MDR基因。

近來，文獻(xiàn)報(bào)道雙鏈探針可作為核酸錯(cuò)配特異識(shí)別探針與目標(biāo)物發(fā)生基于Toehold交換的鏈替代反應(yīng)[25 - 26]。在合適的條件下，雙鏈探針與目標(biāo)物自發(fā)地雜交，且由單堿基錯(cuò)配產(chǎn)生的微小的熱力學(xué)參數(shù)改變即可對(duì)鏈替代效率產(chǎn)生極大影響，從而實(shí)現(xiàn)高特異性檢測(cè)目標(biāo)物。本研究構(gòu)建了一種高特異性且通用的三臂DNA熒光探針。設(shè)計(jì)的探針在檢測(cè)化學(xué)合成MDR基因片斷時(shí)展現(xiàn)出良好的特異性。本實(shí)驗(yàn)不需要酶的輔助且反應(yīng)條件溫和，易于在臨床推廣。此外，該方法對(duì)PCR產(chǎn)物及體液中單鏈DNA或RNA的特異、精準(zhǔn)檢測(cè)有著廣闊的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)原理

基于三臂DNA納米結(jié)構(gòu)的MDR基因檢測(cè)原理示意圖如圖1所示，目標(biāo)識(shí)別部分和信號(hào)報(bào)告部分由兩個(gè)相互獨(dú)立的雜交反應(yīng)組成，并形成一種穩(wěn)定的三臂DNA納米結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)中修飾猝滅基團(tuán)的S1與修飾熒光基團(tuán)的S2相互靠近，使熒光信號(hào)猝滅。當(dāng)體系中存在MDR基因時(shí)，其與Toehold穩(wěn)定結(jié)合進(jìn)而發(fā)生鏈替代反應(yīng)將保護(hù)鏈從互補(bǔ)鏈上置換下來，使S1和S2分離并產(chǎn)生熒光信號(hào)。當(dāng)MDR基因鏈中與Toehold互補(bǔ)的區(qū)域發(fā)生突變時(shí)，MDR基因與檢測(cè)探針結(jié)合不穩(wěn)定，難以引發(fā)鏈替代反應(yīng)。

圖1 基于三臂DNA納米結(jié)構(gòu)的MDR基因檢測(cè)原理示意圖Fig.1 Working principle of three-arm DNA nanoprobe for MDR gene detection

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國)；DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠)；Bio-Rad Laboratories凝膠成像系統(tǒng)(美國)。

過硫酸銨(AP)及四甲基乙二胺(TEMED)(美國Sigma公司)；核酸染料(日本Takara公司)；所有核酸均購自上海生工生物工程有限公司，其序列見表1；其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

2.2 信號(hào)檢測(cè)

將保護(hù)鏈(P1)、互補(bǔ)鏈(C1)、熒光猝滅鏈(S1)和熒光鏈(S2)混合，并用雜交液補(bǔ)充至150 μL，在90 ℃孵育5 min后，立即放在冰上。用不同的處理?xiàng)l件處理，加入50 μL不同濃度的樣本在對(duì)應(yīng)條件下孵育，在激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為496 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm的條件下測(cè)定上述溶液的熒光強(qiáng)度。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次。

2.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis，native-PAGE)

配制8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，在37 ℃浮箱中孵育30 min后取出，每孔按5∶1的比例加入終濃度為1.0 μmol/L的無修飾核酸雜交液和上樣緩沖溶液，在90 mV電壓條件下進(jìn)行65 min后取出膠條，加入染色液避光染色30 min。用凝膠成像系統(tǒng)曝光。

表1 DNA或RNA序列

The bold bases are mismatched bases or delete bases.

2.4 熒光動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

150 μL熒光標(biāo)記的探針與50 μL不同濃度的樣本或50 μL緩沖溶液在石英比色皿中混合均勻后，立即在激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為496 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm的條件下測(cè)定上述溶液的熒光強(qiáng)度。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 三臂DNA納米結(jié)構(gòu)的表征與實(shí)驗(yàn)可行性分析

3.1.1三臂DNA納米結(jié)構(gòu)的熒光表征與可行性分析首先，用熒光動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表征三臂DNA納米結(jié)構(gòu)并分析實(shí)驗(yàn)可行性(圖2(A))。當(dāng)加入FAM-S2后，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)。圖2(A)曲線b表明，向其中加入緩沖液后，熒光信號(hào)因稀釋效應(yīng)而下降。當(dāng)其中加入等體積Dabcyl-S1/P1雜交產(chǎn)物時(shí)，曲線a與曲線b熒光信號(hào)差別不大。當(dāng)其中單獨(dú)加入等體積Dabcyl-S1時(shí)，曲線c熒光信號(hào)下降較曲線a、b明顯，表明除稀釋作用外，游離的Dabcyl-S1與游離的FAM-S2之間可能有部分非特異雜交產(chǎn)物，使熒光下降。當(dāng)其中加入等體積Dabcyl-S1/P1/C1雜交產(chǎn)物時(shí)，熒光信號(hào)下降非常明顯，表明在溶液中形成了三臂DNA納米結(jié)構(gòu)(曲線d、e)，使S2上的熒光基團(tuán)FAM與S1上的猝滅基團(tuán)Dabcyl相互靠近，熒光被猝滅。當(dāng)再次加入緩沖液后，熒光信號(hào)因稀釋作用而下降(曲線d)。而加入相等體積的MDR基因后，熒光信號(hào)先因稀釋作用而下降，后又因MDR基因與三臂DNA納米結(jié)構(gòu)之間發(fā)生反應(yīng)，三臂DNA納米結(jié)構(gòu)裂解使S2上的熒光基團(tuán)FAM與S1上的猝滅基團(tuán)Dabcyl分離，熒光信號(hào)恢復(fù)。

核酸雜交的熱力學(xué)參數(shù)如表2所示。

表2 熱力學(xué)參數(shù)

3.1.2三臂DNA納米結(jié)構(gòu)的native-PAGE表征如圖2(B)所示，三臂DNA納米結(jié)構(gòu)的形成同樣被native-PAGE證明。為避免熒光染料對(duì)電泳過程的干擾，此實(shí)驗(yàn)S1和S2均未修飾猝滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)。泳道6上的條帶(P1/C1)遷移速度低于泳道2條帶(P1)遷移速度，表明P1/C1雜交產(chǎn)物形成。泳道7上的條帶(P1/C1/S1)遷移速度低于泳道6條帶遷移速度，表明P1/C1/S1雜交產(chǎn)物形成。泳道8上的條帶(P1/C1/S1/S2)遷移速度低于泳道7上的條帶遷移速度，表明三臂DNA納米結(jié)構(gòu)的形成。

圖2 (A)三臂DNA納米探針核酸鏈替代反應(yīng)的熒光動(dòng)力學(xué)表征；(B)三臂DNA納米探針的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳表征Fig.2 (A)Characterization of toehold-mediated strand displacement reaction by dynamic fluorescence detection；(B)Nucleic acid hybridization reaction by native-PAGE(A)a.S2(100 μL,200 nmol/L)+S1(50 μL,400 nmol/L)+P1(50 μL,400 nmol/L);b.S2(100 μL,200 nmol/L)+buffer(50 μL);c.S2(100 μL,200 nmol/L)+S1(50 μL,400 nmol/L);d.S2(100 μL,200 nmol/L)+S1(50 μL,400 nmol/L)+P1(50 μL,400 nmol/L)+C1(50 μL,400 nmol/L)+buffer(50 μL);e.S2(100 μL,200 nmol/L)+S1(50 μL,400 nmol/L)+P 1(50 μL,400 nmol/L)+C1(50 μL,400 nmol/L)+MDR gene(50 μL,400 nmol/L);(B)1.20 bp DNA ladder;2.P1;3.C1;4.S1;5.S2;6.P1+C1;7.P1+C1+S1;8.P1+C1+S1+S2;the final concentration of nucleic acid is 1.0 μmol/L.

3.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

如圖3所示，對(duì)反應(yīng)體系中的核酸鏈P1與C1濃度的比例、S1與S2濃度的比例、孵育時(shí)間、孵育溫度進(jìn)行了優(yōu)化。核酸鏈P1與C1的比例對(duì)信噪比的影響見圖3(A)，P1與C1濃度的最優(yōu)比為0.8∶1。超過或低于這一比例時(shí)，信噪比逐漸降低。因而S1與S2最優(yōu)比選擇0.8∶1。S1與S2的比例對(duì)信噪比的影響見圖3(B)，S1與S2濃度的最優(yōu)比為2∶1。超過或低于這一比例時(shí)，信噪比逐漸降低。因而S1與S2最優(yōu)比選擇2∶1。圖3(C)對(duì)孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)加入相同濃度和體積的MDR基因后，37 ℃條件下，孵育時(shí)間在30 min左右時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到平衡。因此后續(xù)試驗(yàn)選擇30 min孵育時(shí)間。孵育溫度對(duì)熒光信號(hào)的影響如圖3(D)所示， 37 ℃時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇37 ℃作為孵育溫度。

圖3 (A)P1與C1濃度比對(duì)信噪比的影響；(B)S1與S2濃度比對(duì)信噪比的影響；(C)孵育時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響；(D)孵育溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 (A)Signal-to-noise ratio at various concentration ratio of P1 and C1；(B)Signal-to-noise ratio at various concentration ratio of S1 and S2；(C)Fluorescence intensity at different incubation time；(D)Fluorescence intensity at different incubation temperatures(A)S1,200 nmol/L;S2,200 nmol/L;MDR,50 nmol/L;(B)P1,160 nmol/L;C,200 nmol/L;MDR,50 nmol/L;(C)S1,400 nmol/L;S2,200 nmol/L;P1,160 nmol/L;C1,200 nmol/L;MDR,50 nmol/L;(D)S1,400 nmol/L;S2,200 nmol/L;P1,160 nmol/L;C1,200 nmol/L.MDR,50 nmol/L.All the experiments were repeated thrice.

3.3 三臂DNA納米結(jié)構(gòu)檢測(cè)性能分析

如圖4所示，本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛎黠@區(qū)分野生型MDR基因與突變型MDR基因。為驗(yàn)證本方法對(duì)MDR基因點(diǎn)突變的特異識(shí)別能力，用區(qū)別因子(DF),DF=ΔFwild/ΔFmutation(Δ代表除去背景信號(hào))對(duì)野生型MDR基因及2m,3m,3d,5m,5d幾種突變型MDR基因進(jìn)行評(píng)估。在濃度相同的情況下，三臂DNA納米探針的最高區(qū)別因子為24.1，最低區(qū)別因子為4.1，平均為11.8。更重要的是，其對(duì)不同突變位點(diǎn)的MDR基因展示出明顯的區(qū)別因子，且對(duì)同一位點(diǎn)的不同突變類型也展示出良好的區(qū)別因子。該方法最高特異性區(qū)別能力與其他檢測(cè)方法相比有明顯提高[27]。以上結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)有很好的單堿基突變識(shí)別能力。盡管許多方法被用于提高核酸檢測(cè)的特異性，例如分子信標(biāo)[28]、DNA酶的特異性識(shí)別[29]、化學(xué)修飾[30]以及級(jí)聯(lián)鏈替代反應(yīng)[31]等，但是以上方法或不適合檢測(cè)長(zhǎng)片段目標(biāo)DNA，或價(jià)格昂貴不適合臨床推廣。

圖4 (A,B)三臂DNA納米探針檢測(cè)野生型MDR基因和不同位點(diǎn)突變型MDR基因的熒光強(qiáng)度；(C)三臂DNA納米探針對(duì)野生型MDR基因和不同位點(diǎn)突變型MDR基因的區(qū)別能力Fig.4 (A,B)Fluorescence intensity of wild MDR gene and mutant MDR gene at different mutational site;(C)The specificity of probe for MDR mutation genes was evaluated by DFs(A,B)S1,400 nmol/L;S2,200 nmol/L;P,160 nmol/L;C,200 nmol/L;wild MDR gene and mutant MDR gene,50 nmol/L.All the experiments were repeated thrice.

如圖5(A)所示，在最佳條件下，用動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)不同濃度MDR基因?qū)晒庑盘?hào)的影響，熒光強(qiáng)度與MDR基因濃度有很好的線性關(guān)系。如圖5(B)所示，用終點(diǎn)法檢測(cè)不同濃度的MDR基因，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性方程為：y=2.0709x+1.1963(R2=0.9825)。其中，y為熒光強(qiáng)度，x為MDR基因濃度(nmol/L)。說明熒光強(qiáng)度隨著MDR基因濃度的增加而增加。

圖5 (A)檢測(cè)方法對(duì)不同濃度MDR基因的相應(yīng)曲線;(B)檢測(cè)方法的校正曲線Fig.5 (A)Fluorescence curves of this method at different concentration of MDR gene;(B)The calibration curve of this methodfrom the bottom to up:0 nmol/L to 120 nmol/L;S1,400 nmol/L;S2,200 nmol/L;P,160 nmol/L;C,200 nmol/L.All the experiments were repeated thrice.

3.4 三臂DNA納米結(jié)構(gòu)的通用性實(shí)驗(yàn)

為了證明本方法的通用性，對(duì)miR-21進(jìn)行了檢測(cè)。如圖6(A)所示，先用UNA fold software(http://mfold.rna.albany.edu/)模擬了S2 與 C′,S1 與 P′ 之間的雜交，顯示無其他二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。如圖6(B)所示，用該探針對(duì)miR-21進(jìn)行檢測(cè)，野生型miR-21產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)，而突變型miR-21的熒光信號(hào)與野生型miR-21相比明顯降低，幾乎與空白對(duì)照組熒光信號(hào)相同，表明突變型miR-21不能有效的與三臂DNA納米結(jié)構(gòu)發(fā)生鏈替代反應(yīng)。這一實(shí)驗(yàn)表明，三臂DNA納米探針在不需要重新設(shè)計(jì)信號(hào)報(bào)告部分的前提下，可用于檢測(cè)miR-21。同時(shí)也說明本方法具備檢測(cè)其他目標(biāo)DNA的能力，有很好的通用性。

圖6 (A)軟件模擬S2與C′，S1與P′雜交產(chǎn)物;(B)檢測(cè)野生型與突變型miR-21Fig.6 (A)Hybridization product between S2 and C′,S1 and P′ evaluated by software;(B)Wild type and mutant miR-21 detectionS1:400 nmol/L;S2:200 nmol/L;P′:160 nmol/L;C′:200 nmol/L;miR-21 and 3d′:100 nmol/L.All the experiments were repeated thrice.

3.5 樣本回收率測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)本方法進(jìn)行回收率測(cè)定。從重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院大公館分院檢驗(yàn)科收集人血清，加入3個(gè)不同濃度梯度的化學(xué)合成MDR基因樣本，按本方法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次測(cè)定的平均回收率為99.0%～101.7%(表3)，說明此方法具備對(duì)實(shí)際樣本的檢測(cè)能力。

表3 MDR基因回收率測(cè)定(n=3)

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一種新型的三臂DNA納米探針檢測(cè)MDR基因，其最高區(qū)別因子為24.1，最低區(qū)別因子為4.1，平均區(qū)別因子為11.8。對(duì)不同突變位點(diǎn)的MDR基因和對(duì)同一位點(diǎn)不同突變類型的MDR基因，三臂DNA納米探針均展示出明顯的區(qū)別因子。用標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)混合人血清中MDR基因時(shí)，回收率在99.0%～101.7%之間。此外，本實(shí)驗(yàn)不需重新設(shè)計(jì)信號(hào)報(bào)告鏈即可實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-21的檢測(cè)。本方法特異性高、通用性好、不需酶的輔助且條件溫和，為單鏈PCR產(chǎn)物及體液中單鏈DNA或RNA的精準(zhǔn)檢測(cè)提供了有力的技術(shù)支撐。