基于微流控芯片的熒光定量PCR法快速檢測乙肝病毒核酸

王可可， 楊 柯， 趙 俊， 朱燦燦， 朱 靈*， 劉 勇

(1.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院應(yīng)用技術(shù)研究所，安徽省生物醫(yī)學(xué)光學(xué)儀器工程技術(shù)研究中心，安徽省醫(yī)用光學(xué)診療技術(shù)與裝備工程實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031;2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽合肥 230026)

血液病毒感染是一個(gè)嚴(yán)峻的全球性問題，而血站在確保輸血安全這一過程中扮演著非常重要的角色。常規(guī)的血液病毒篩查方法，如酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法，其檢測靈敏度低且病毒檢測的“窗口期”較長[1]。為此，人們發(fā)展了核酸擴(kuò)增檢測(NAT)方法，與傳統(tǒng)的免疫學(xué)篩查方式相比，NAT具有高度的靈敏性和特異性，可大幅降低病毒檢測“窗口期”，有效彌補(bǔ)了ELISA方法中病毒變異、免疫靜默等原因造成的漏檢[2]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于血站血液核酸病毒的篩查[3]。

目前省級(jí)中心血站的NAT檢測設(shè)備，如羅氏Cobas s201系統(tǒng)、諾華(chiron)TIGRIS全自動(dòng)核酸檢測分析系統(tǒng)、上海浩源ChiTaSBSS1200核酸血液篩查系統(tǒng)，他們共同特點(diǎn)是主要由混樣儀、核酸提取儀和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)儀等組成，價(jià)格昂貴，且存在檢測步驟繁瑣、檢測成本高等問題，不利于推廣應(yīng)用。特別是難以滿足即時(shí)診斷(POCT)方面的需求，因此，研發(fā)一種自動(dòng)化、低成本且適宜于中小型血站使用的新型核酸分析設(shè)備十分重要。

微流控芯片技術(shù)經(jīng)過多年的發(fā)展已成為一種理想低成本檢測平臺(tái)[4]，在生命科學(xué)領(lǐng)域，尤其是在核酸檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用[5]。與此同時(shí)，隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展，使得微流控芯片上實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的靈活設(shè)計(jì)與快速制備成為可能[6]。本研究采用3D打印和聚二甲基硅氧烷(PDMS)注塑模技術(shù)，制作了一種集成芯片氣動(dòng)閥和“樹型”結(jié)構(gòu)為一體的微流控芯片，對(duì)芯片進(jìn)行了熱力學(xué)仿真，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的微流控?zé)晒舛縋CR分析系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了血液中HBV病毒的快速檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Objet 30Pro 3D打印機(jī)(美國，Stratify公司)；PDC-32G等離子清洗機(jī)(美國，Harrick公司)；自制實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增分析儀，其熒光檢測系統(tǒng)檢測波長為510 nm，溫控精度為0.1 ℃[7]；KW-4A型臺(tái)式勻膠機(jī)(中國)。

聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sluggard 184，美國DowCorning公司)；乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)(1型)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法，上海浩源生物科技有限公司)；無水乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)；硅油(美國Sigma公司)；血液樣本由安徽省血液中心提供。

HBV、HCV、HIV特異性引物和Taqman探針的設(shè)計(jì)：針對(duì)HBV、HCV、HIV基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)擴(kuò)增這3種病毒特異性引物和Taqman水解探針，用于對(duì)應(yīng)基因片段的擴(kuò)增，引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列見表1。

表1 HBV、HCV、HIV實(shí)時(shí)熒光定量PCR/RT-PCR引物和探針

1.2 芯片設(shè)計(jì)

芯片借鑒經(jīng)典的“三明治結(jié)構(gòu)”設(shè)計(jì)[8]，分為四層。如圖1(A)中所示：上層為芯片的氣路控制層；第二層為PDMS薄膜用于微閥的封閉和開啟；第三層為芯片的液路層；底層則為玻璃基底。芯片整體功能如圖1(B)所示，分布有主通道、分支通道、反應(yīng)腔和廢液腔；芯片大小32×38×4 mm，其中主通道長30 mm，高0.5 mm，負(fù)責(zé)樣品的進(jìn)樣；分支通道負(fù)責(zé)分流試劑到反應(yīng)腔；每個(gè)反應(yīng)腔體積約為15 μL，兩端均設(shè)有微閥和排氣孔，用來控制反應(yīng)腔試劑進(jìn)樣和密封；廢液腔則用來儲(chǔ)存多余的廢液。針對(duì)血站血液篩查檢測對(duì)象及流程，在芯片上設(shè)置六個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)腔1～6分別作為HBV、HCV、HIV三種病毒的陰性和陽性對(duì)照腔，其余反應(yīng)腔分為3組分別作為三種病毒檢測實(shí)驗(yàn)的復(fù)孔。

圖1 (A)微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；(B)微流控芯片功能示意圖Fig.1 (A)Structure schematic of microfluidic chip;(B)Features schematic of microfluidic chip

1.3 芯片制備

使用Soildworks軟件設(shè)計(jì)微流控芯片所需模具結(jié)構(gòu)，使用3D打印機(jī)打印芯片模具[9]，設(shè)置打印精度為16 μm。微流控芯片制備采用注塑法。PDMS前聚體和促凝劑以10∶1比例均勻混合后置于真空抽氣泵中除去氣泡備用。將PDMS倒入芯片模具并置于100 ℃恒溫烘箱中烘烤固化2 h，以制備微流控芯片上下基片；同時(shí)緩慢傾倒約1 mL PDMS在4英寸的硅基片中央，置于勻膠機(jī)中，設(shè)置初始轉(zhuǎn)速為500 r/min，保持時(shí)間18 s，隨后升高轉(zhuǎn)速至700 r/min，保持55 s，最后將硅片放入烘箱中烘烤10 min以制備微流控芯片薄膜。從模具上取出PDMS上下芯片和PDMS薄膜，并用氧等離子清洗機(jī)處理45 s，使芯片永久鍵合。

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)腔體內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)通常會(huì)產(chǎn)生氣泡，造成不同反應(yīng)腔體之間反應(yīng)液串樣或反應(yīng)液從排氣孔處泄露。為提高實(shí)驗(yàn)成功率，推薦在實(shí)驗(yàn)開始前注入去離子水預(yù)先浸潤芯片1 h[10]。

1.4 芯片熱力學(xué)仿真

PCR過程有3個(gè)不同的溫度階段，而反應(yīng)容器良好的導(dǎo)熱性和溫度均勻性是微流控芯片上能否成功進(jìn)行PCR的關(guān)鍵。因此，本研究針對(duì)所設(shè)計(jì)芯片進(jìn)行熱力學(xué)仿真，探究芯片在特定溫度下的導(dǎo)熱性能和溫度均勻性。將芯片的Solidworks源文件轉(zhuǎn)換為SLDPRT格式并導(dǎo)入到Comsol仿真軟件的幾何模型之中，對(duì)芯片加載不同材料并設(shè)置導(dǎo)熱的邊界條件和求解域，其中芯片材質(zhì)分別設(shè)置為PDMS(厚度3.7 mm)和玻璃(厚度0.3 mm)，并基于PCR過程的3個(gè)溫度階段設(shè)置芯片底面溫度曲線，仿真特定溫度下設(shè)計(jì)微流控芯片的導(dǎo)熱性和溫度均勻性，其中溫度設(shè)置如圖2(A)曲線所示，芯片材料設(shè)定如圖2(B)和圖2(C)所示。

圖2 (A)仿真時(shí)施加的溫度場曲線；(B)芯片幾何模型中的PDMS材質(zhì)部分；(C)芯片幾何模型中的Glass材質(zhì)部分Fig.2 (A)The temperature field curve applied in the simulation；(B)PDMS material components in the chip geometry model；(C)Glass material components in the chip geometry model

1.5 PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)置

將對(duì)照組反應(yīng)試劑加入到1～6號(hào)獨(dú)立反應(yīng)腔，并進(jìn)行封閉。然后，將HBV、HCV、HIV實(shí)時(shí)熒光定量PCR/RT-PCR引物和探針分別預(yù)埋到反應(yīng)腔7和8、9與10、11和12中，打開每個(gè)反應(yīng)腔兩端的微閥，將從血液樣品中提取出的核酸溶液與PCR擴(kuò)增試劑混勻后，從加樣孔注入到主通道內(nèi)，反應(yīng)液會(huì)在芯片的親水性和壓力作用下依次填充反應(yīng)腔，關(guān)閉微閥，封閉反應(yīng)腔排氣孔，再注入硅油充盈主通道以隔離反應(yīng)腔。進(jìn)樣完成后，將芯片置于自行研制的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀內(nèi)，于熱層上均勻涂抹導(dǎo)熱硅脂以增強(qiáng)芯片溫度均勻性。設(shè)置PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)，程序?yàn)椋?7 ℃，2 min，1個(gè)循環(huán)；50 ℃，5 min，1個(gè)循環(huán)；42 ℃，35 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃，10 min，1個(gè)循環(huán)；隨即擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)(94 ℃，10 s；55 ℃，15 s；65 ℃，45 s)。整個(gè)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中CCD相機(jī)于每個(gè)循環(huán)內(nèi)65 ℃ 結(jié)束時(shí)完成芯片熒光信號(hào)的采集，并實(shí)時(shí)分析處理數(shù)據(jù)繪制擴(kuò)增曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱力學(xué)仿真

對(duì)PCR過程中不同溫度階段(94 ℃、55 ℃、65 ℃)的芯片進(jìn)行了熱仿真分析，三個(gè)溫度階段內(nèi)芯片的溫度均勻性和導(dǎo)熱性能良好。圖3(A)所示是94 ℃條件下芯片整體溫度仿真結(jié)果，12個(gè)反應(yīng)腔無溫度差異，性能高度一致，芯片溫度均勻性良好；圖3(B)是此條件下芯片的等溫面，等溫面的形成與芯片的高度密切相關(guān)，反應(yīng)腔所在高度可保證最大的溫度傳遞性能，使得反應(yīng)腔溫度與芯片基底溫度保持同步。但此時(shí)芯片反應(yīng)腔最高溫度只有366.22 K比預(yù)設(shè)的溫度94 ℃(367.15 K)低了0.93 ℃左右，說明芯片內(nèi)部溫度相較于預(yù)設(shè)溫度會(huì)略有偏低，此點(diǎn)符合實(shí)際條件下芯片的導(dǎo)熱情況，說明仿真結(jié)果的可靠性。在實(shí)際溫控過程中，通常會(huì)在溫控算法的缺省溫度條件設(shè)置時(shí)通過調(diào)節(jié)PID參數(shù)，將不同溫度階段的初始溫度設(shè)置偏高，使得芯片反應(yīng)腔溫度最大程度上與圖2(A)中理想的溫度曲線一致。

圖3 微流控芯片熱仿真結(jié)果Fig.3 Results of microfluidic chip thermal simulation

2.2 核酸檢測

圖4 擴(kuò)增曲線Fig.4 Amplification curves

芯片上病毒核酸擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，可以看出腔體1、3、5中HBV、HCV、HIV三種病毒陽性對(duì)照均得到有效擴(kuò)增；相對(duì)應(yīng)的，腔體2、4、6中陰性對(duì)照則無擴(kuò)增，說明整個(gè)測試結(jié)果滿足質(zhì)控要求。對(duì)于待測樣本的檢測結(jié)果，可以觀測到HBV引物探針對(duì)應(yīng)的腔體7和8中熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)；而HCV引物探針對(duì)應(yīng)的腔體9和10，HIV引物探針對(duì)應(yīng)的腔體11和12中熒光信號(hào)均無明顯變化，表明該血液核酸樣品中含有HBV DNA，通過實(shí)時(shí)計(jì)算，確定其Ct值在37左右，檢測結(jié)果呈HBV弱陽性。因此，可以初步表明該型芯片可以用于血液篩查中病毒核酸的檢測。

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)的微流控芯片導(dǎo)熱性能和溫度均勻性良好，在芯片上成功檢測出血液樣本中的HBV。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血液樣本熒光PCR擴(kuò)增的Ct值約為37，呈HBV弱陽性。本研究受限于難以獲得HCV和HIV陽性樣本，因此，未能在該型芯片上完成對(duì)HCV和HIV的測試，但對(duì)這兩種病毒在微流控芯片上的檢測仍具有很大的參考性，并可進(jìn)一步優(yōu)化芯片設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)多種病毒核酸的并行檢測，為后續(xù)微流控芯片上集成化血液核酸檢測系統(tǒng)研究打下了基礎(chǔ)，在血站血液病毒核酸檢測和術(shù)前血液篩查等即時(shí)診斷方面有很好的應(yīng)用前景。