馬鈴薯皮黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究

江震宇 陳佳靜 葛宇飛 陳 卓 程林潤 徐麗珊

(浙江師范大學化學與生命科學學院1，金華 321004) (金華市農(nóng)業(yè)科學研究院2，金華 321017)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)俗稱土豆，茄科茄屬一年生草本植物。由于其產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富，目前馬鈴薯已經(jīng)成為中國第5大糧食作物，2011年我國馬鈴薯種植面積達到542.67 萬公頃，總產(chǎn)量8 835.02萬t，占糧食總產(chǎn)量的15.51%[1]。

馬鈴薯皮是馬鈴薯加工和消費中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)品，一般不被人們所利用。馬鈴薯皮的丟棄不僅導致了廢物處理問題，而且造成了食品行業(yè)的重大經(jīng)濟損失。研究表明，馬鈴薯皮中富含黃酮類、生物堿、花青素、綠原酸等化合物[2-5]，其中黃酮類化合物具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂等多種保健功效[6-7]。

近年來，已有研究者對馬鈴薯皮黃酮進行了初步的研究[8-10]，然而目前鮮見關于微波輔助提取馬鈴薯皮黃酮工藝的報道。微波輔助提取技術是國內(nèi)外常用的植物活性成分提取技術[11]，其主要是依靠微波場來加速活性成分的溶出。菜籽油是我國南方常見的食用油之一，其極易發(fā)生氧化，氧化產(chǎn)物對人體具有毒副作用。因此本實驗采用單因素實驗法和響應面法優(yōu)化微波輔助提取馬鈴薯皮黃酮的工藝條件，并通過測定馬鈴薯皮黃酮對DPPH·的清除能力及對菜籽油儲存過程中過氧化值的影響研究其抗氧化活性，以期為充分利用馬鈴薯資源，實現(xiàn)馬鈴薯皮的“廢物再利用”，開發(fā)綠色、安全、高效的天然馬鈴薯皮抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯(中薯3號)：金華市農(nóng)科院，洗凈取其皮(厚度1～2 mm)，100 ℃殺青后60 ℃烘干，粉碎過篩備用。菜籽油：購于榨油廠，選取新鮮的菜籽用物理方法壓榨而成，無任何添加成分。

蘆丁、維生素C(VC)等標準品：美國Sigma公司；2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)：日本東京化成工業(yè)公司；AB-8大孔吸附樹脂：上海藍季科技發(fā)展有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、三氯甲烷等均為國產(chǎn)分析純：金華醫(yī)藥公司。

1.2 儀器與設備

FW135粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海恒科技有限公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：瑞士布奇公司；MDS-8G微波消解儀：上海新儀微波化學科技有限公司；HWS28恒溫水浴鍋：上海恒科學儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司。

1.3 馬鈴薯黃酮提取液的制備

一定質(zhì)量的馬鈴薯皮粉和乙醇溶液，按一定液固比(mL∶g)，充分混合后進行微波輔助提取。提取結(jié)束后，提取液于4 ℃，4 500 r/min離心10 min，取上清液定容，即得馬鈴薯皮黃酮提取液。

1.4 馬鈴薯皮黃酮含量的測定

采用硝酸鋁顯色法[12]，測定馬鈴薯皮提取液的黃酮含量。以蘆丁溶液濃度為橫坐標， 510 nm處的吸光值為縱坐標繪制標準曲線，吸光度(y)與蘆丁濃度(x)(0～0.3 mg/mL)之間的關系為y=11.6x-0.002，相關系數(shù)為R2=0.999 6。吸取5.0 mL待測樣品液于10.0 mL試管中，加入0.2 mL 5% NaNO2溶液，混勻。靜置6 min后加入0.2 mL 10% Al(NO3)3溶液，混勻，靜置6 min，再吸取1.0 mL1 mol/L NaOH加入試管，混勻，靜置15 min，于510 nm處測定樣品的吸光值，根據(jù)式(1)，計算出黃酮含量。

(1)

式中:y為樣品于510 nm處的吸光度；n為樣品被稀釋的倍數(shù)；V為提取液的體積/mL；m為馬鈴薯皮粉末的質(zhì)量/g。

1.5 單因素實驗

分別考察提取溫度50、60、70、80、90 ℃；微波功率500、600、700、800、900 W；提取時間15、20、25、30、35 min；液固比(mL∶g)15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1；乙醇體積分數(shù)50%、60%、70%、80%、90%對馬鈴薯皮黃酮得率的影響。從實驗結(jié)果分析確定考察區(qū)間，以此作為響應面中心組合設計實驗方案的基礎。

1.6 響應面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，確定微波功率為700 W、提取時間為25 min，以黃酮得率為響應值(Y)，以乙醇濃度(A)、液固比(B)、提取溫度(C)為自變量，采用Box-Behnken中心組合設計實驗，通過建立模型分析實驗結(jié)果，以確定提取的最佳工藝條件。

1.7 馬鈴薯皮黃酮的制備及純化

按最佳工藝條件提取馬鈴薯皮黃酮，得到的提取液于50 ℃減壓濃縮近干，真空干燥，得馬鈴薯皮黃酮。取一定質(zhì)量的馬鈴薯皮黃酮將其完全溶解，加入2 g 活化后的AB-8大孔吸附樹脂，于恒溫振蕩器(28 ℃)振蕩吸附4 h，棄去未吸附的溶液，加入一定量的95%的乙醇溶液，于恒溫振蕩器(28 ℃)振蕩吸附2 h。收集解析液于50 ℃減壓濃縮近干，真空干燥，得馬鈴薯皮黃酮純化物，按照1.4的方法測定其黃酮含量。

1.8 體外抗氧化活性測定

1.8.1 DPPH·清除活性

參照Liu等[13]方法，將不同濃度的馬鈴薯皮黃酮溶液和VC溶液(陽性對照)各1 mL與2 mL 0.15 mmol/L的DPPH·溶液(70%乙醇配制)混勻后，避光反應30 min，于517 nm處測定吸光值Ai；1 mL 70%乙醇溶液與2 mL DPPH·溶液混勻后，避光反應30 min，于517 nm處測定吸光值Ac；將不同濃度的馬鈴薯皮黃酮和VC溶液各1 mL與2 mL 70%乙醇溶液混勻后，避光反應30 min，于517 nm處測定吸光值Aj，按式(2)計算清除率。

(2)

1.8.2 菜籽油抗氧化活性

1.8.2.1 馬鈴薯皮黃酮提取物對菜籽油過氧化值的影響

采用Schaal烘箱法進行測定[14]，在裝有等質(zhì)量的菜籽油廣口瓶中分別加入油重0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的馬鈴薯皮黃酮，振蕩混勻，以VC為陽性對照，菜籽油為空白對照，置于(65±1) ℃的烘箱，24 h后測定菜籽油的過氧化值。根據(jù)上述結(jié)果，選取適合的黃酮濃度進一步實驗，在裝有等質(zhì)量的菜籽油廣口瓶中分別加入等質(zhì)量百分比的馬鈴薯皮黃酮和VC，以菜籽油為空白對照，每間隔24 h測定試樣的過氧化值。

1.8.2.2 過氧化值的測定

參照GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標準的分析方法》[15]中的4.2.2比色法進行測定。繪制標準曲線，得到吸光度(y)與鐵質(zhì)量(x)的標準曲線關系為y=0.030 36x-0.081 58，R2=0.998 07。相同方法測定樣品的吸光值，根據(jù)式(3)，計算過氧化值。

(3)

式中：c為由標準曲線計算得到樣品中的鐵質(zhì)量/μg；c0為由標準曲線計算得到零管中的鐵質(zhì)量/μg；V1為樣品稀釋總體積/mL；V2為樣品測定取樣體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.9 數(shù)據(jù)處理

本實驗所有數(shù)值均為三次以上測定值，以平均值±標準偏差表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析，P<0.01為差異極顯著，0.01≤P≤0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

由圖1可知，隨著提取溫度的增加，馬鈴薯皮黃酮得率先增加后減小，在70 ℃達到最大值(5.69±0.21) mg/g，之后便迅速下降。當微波功率由500 W上升到700 W時，馬鈴薯皮黃酮得率隨之而增加，在700 W時達到最大值(6.02±0.04) mg/g，800 W后含量趨于平緩，因此選取700 W為最佳微波功率。馬鈴薯皮黃酮得率隨著提取時間的增加先增加后緩慢減少，在25 min時達到最大值(6.03±0.49) mg/g，據(jù)此，擬定最佳的提取時間為25 min。當液固比在15∶1～20∶1之間時，馬鈴薯皮黃酮得率逐漸增加，當達到20∶1時，得率最高為(6.17±0.17) mg/g，當液固比大于20∶1時，黃酮得率呈現(xiàn)下降趨勢。當乙醇體積分數(shù)由50%上升至70% 時，馬鈴薯皮黃酮隨之增加，在70%時達到最大值(5.97±0.11) mg/g，乙醇濃度繼續(xù)上升時，黃酮得率顯著下降。

圖1 五因素對馬鈴薯皮黃酮得率的影響

2.2 響應面優(yōu)化馬鈴薯皮黃酮提取工藝

2.2.1 實驗設計及結(jié)果

在單因素實驗的基礎上，確定在微波功率700 W、提取時間25 min的條件下，分別以乙醇濃度(A)、液固比(B)、提取溫度(C)為考察因素，以黃酮得率為實驗指標，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，設計三因素三水平分析實驗，實驗設計及結(jié)果見表1。

表1 實驗設計及結(jié)果

2.2.2 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

通過Design-Expert 8.05b響應面分析軟件分析，方差如表2所示。得到馬鈴薯皮黃酮得率(Y)對自變量乙醇濃度(A)、液固比(B)、提取溫度(C)的二次多項回歸方程：Y=6.46-0.21A+0.25B-0.091C-0.32AB+0.099AC+0.17BC-1.06A2-0.89B2-0.77C2。F檢驗顯示模型具有很高的F值和極低的P值(P<0.01)，說明模型高度顯著。失擬項為0.081 6，沒有達到顯著水平，表明所建立的回歸模型可以用來分析該工藝條件。在一次項中的A、B以及二次項中的A2、B2、C2對黃酮得率的影響達到極顯著水平，C達到顯著水平，這表明這3個因素與黃酮得率有直接的關系，是影響得率的主要因子。

注：P<0.01，差異極顯著**；P<0.05，差異顯著*

圖2 各因素交互作用對馬鈴薯皮黃酮得率的影響

2.2.3 交互作用分析

響應面圖形是控制其中一個因素在0水平，響應值對應其余2個因素所做的三維曲面圖和等高線圖，其可以直觀地反映出各因素及其兩兩之間的交互作用對響應值的影響[16-17]。由圖2a可以看出乙醇濃度和液固比具有明顯的交互作用，當提取溫度一定時，黃酮得率隨著液固比的增大而增大，達到最大值后變?yōu)橄陆担汗瘫葘憫档挠绊懸才c其相類似；圖2b顯示乙醇濃度與提取溫度之間具有明顯的交互作用，當液固比一定時，黃銅得率隨著乙醇濃度的升高而升高，達到最大值后隨即降低，提取溫度對黃酮得率的影響也與之相類似；圖2c顯示液固比與提取溫度也具有明顯的交互作用，固定乙醇濃度不變，隨著液固比的增大，黃酮得率先升高后降低，提取溫度對黃酮得率的影響也呈現(xiàn)此規(guī)律。

2.2.4 最佳工藝條件確定與驗證

通過Design-Expert 8.05b軟件分析，馬鈴薯皮黃酮類物質(zhì)提取的最佳條件是乙醇濃度68.78%，液固比20.81∶1，提取溫度70.34 ℃。在最佳提取條件下預測黃酮得率最大值為6.49 mg/g。綜合考慮實際，確定最后修正的最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)70%、液固比20∶1、提取溫度70 ℃，在此條件下驗證實驗，結(jié)果顯示黃酮得率為(6.50±0.06) mg/g，與模型預期值差異不顯著。說明該優(yōu)化結(jié)果可靠，可以用于指導馬鈴薯皮黃酮的提取工藝。

2.3 馬鈴薯皮黃酮的制備及純化

通過該最優(yōu)條件制備得到的馬鈴薯皮黃酮，其得率為(29.87±0.08)%，黃酮含量為(21.80±0.03) mg/g。根據(jù)1.7所述方法對馬鈴薯皮黃酮進行純化，得到純化后的馬鈴薯皮黃酮純化物，其中黃酮含量達到(657.92±0.07) mg/g。

2.4 馬鈴薯皮黃酮抗氧化活性的研究

2.4.1 馬鈴薯皮黃酮對DPPH·的清除作用

馬鈴薯皮黃酮對DPPH·的清除能力結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，隨著濃度的升高，其對DPPH·的清除能力也隨之增強。計算得到馬鈴薯皮黃酮對DPPH·清除率的IC50值為(1.02±0.07) mg/mL，與VC的IC50[(7.96±0.03) μg/mL]相比雖較大，但其仍然具有較好的DPPH·清除能力。同時發(fā)現(xiàn)其IC50與馬鈴薯皮黃酮純化物的IC50[(30.18±0.02) μg/mL]所成的倍數(shù)關系剛好與兩者黃酮含量所呈倍數(shù)相當，說明馬鈴薯皮中的黃酮類物質(zhì)是使馬鈴薯皮黃酮具有良好的清除DPPH·能力的主要物質(zhì)。

圖3 馬鈴薯皮黃酮對DPPH·的清除能力

2.4.2 馬鈴薯皮黃酮抗菜籽油抗氧化的作用

以VC為陽性對照，研究24 h后不同濃度的馬鈴薯皮黃酮對菜籽油的抗氧化性，見圖4。當質(zhì)量為油重的0.02%時，馬鈴薯皮黃酮緩解菜籽油過氧化值上升的效果已與相同濃度的VC作用相當。當質(zhì)量≥油重的0.04%時，其對菜籽油的抗氧化作用顯著、極顯著優(yōu)于VC。不同時間馬鈴薯皮黃酮、以及與其黃酮含量相當?shù)鸟R鈴薯皮黃酮純化物對菜籽油過氧化值的影響見圖5。隨著時間的增加，加入馬鈴薯皮黃酮、馬鈴薯皮黃酮純化物的菜籽油過氧化值極顯著低于空白菜籽油，且兩者對菜籽油過氧化值的影響無顯著差異，說明馬鈴薯皮中的黃酮類物質(zhì)是使馬鈴薯皮黃酮具有良好的抗菜籽油氧化能力的主要物質(zhì)。

圖4 馬鈴薯皮黃酮及VC對菜籽油過氧化值的影響

圖5 不同時間馬鈴薯皮黃酮對菜籽油過氧化值的影響

3 結(jié)論

本研究在單因素實驗的基礎上，通過響應面法對微波提取馬鈴薯皮黃酮工藝進行優(yōu)化，得到其最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)70%、液固比20∶1、提取溫度70 ℃、微波功率700 W、提取時間25 min，此時黃酮的得率為(6.50±0.06) mg/g。通過該最優(yōu)條件制備得到的馬鈴薯皮黃酮，其得率為(29.87±0.08)%，黃酮含量為(21.80±0.03)mg/g。使用AB-8大孔吸附樹脂對馬鈴薯皮黃酮進行初步純化，使其黃酮含量升至(657.92±0.07) mg/g。

對馬鈴薯皮黃酮進行抗氧化活性測定，發(fā)現(xiàn)其具有較好的DPPH·清除能力，清除率的IC50為(1.02±0.07) mg/mL。同時發(fā)現(xiàn)馬鈴薯皮黃酮具有良好的抗菜籽油氧化活性，當質(zhì)量為油重的0.02%時，馬鈴薯皮黃酮緩解菜籽油過氧化值上升的效果與相同濃度的VC作用相當。當質(zhì)量≥油重的0.04%時，馬鈴薯皮黃酮對菜籽油的抗氧化作用顯著優(yōu)于VC。綜上所述，馬鈴薯皮黃酮具有較好的抗氧化活性，進一步的實驗表明，馬鈴薯皮中的黃酮類物質(zhì)是使其具有抗氧化活性的主要功效物質(zhì)。

綜合分析，馬鈴薯皮中富含黃酮類物質(zhì)，且其黃酮提取物具有較好的DPPH·清除能力和抗菜籽油氧化能力，可進一步研制成天然抗氧化劑，用于防止或延緩食品的氧化。