大豆膳食纖維對(duì)糖尿病大鼠胰腺氧化損傷修復(fù)作用

佐兆杭 王 穎,2 宮 雪 劉淑婷 王 迪張東杰 張玉先 于寒松 曹龍奎,2

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)1， 大慶 163319) (國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心2， 大慶 163319) (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院3， 長(zhǎng)春 130118)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，各種健康問(wèn)題也在逐漸凸顯。其中糖尿病已同心腦血管疾病及惡性腫瘤并列為人類健康三大殺手[1]。相關(guān)調(diào)查結(jié)果表明，世界糖尿病患者的總?cè)藬?shù)預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)到4.39億[2]。大量研究表明，2型糖尿病及其各類并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，與患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的顯著改變有關(guān)。患者體內(nèi)抗氧化能力減弱，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，其體內(nèi)大量的氧自由基可對(duì)胰島β細(xì)胞造成損傷，并降低機(jī)體對(duì)胰島素的耐受性，從而誘發(fā)2型糖尿病[3-4]。目前常用于糖尿病治療的臨床藥物多為磺酰脲類等化學(xué)西藥，雖然能較好地控制患者的血糖水平，但其多伴有毒副作用，對(duì)患者的肝、腎功能等有較強(qiáng)的損傷，且對(duì)氧化損傷的修復(fù)效果不顯著[5]。因此，尋找一種安全、低毒并能有效修復(fù)機(jī)體氧化損傷的天然產(chǎn)物替代西藥，對(duì)治療糖尿病具有深遠(yuǎn)意義。

膳食纖維(Dietary Fibre，DF)是一種具有抗消化特性且在小腸中不能消化的碳水化合物或其類似物，包括一部分不能消化的多糖、低聚糖及其他植物締合物[6]。目前許多專家都建議將膳食纖維列為“第七營(yíng)養(yǎng)素”，其生理功能主要有：增加飽腹感、調(diào)節(jié)糖尿病患者的血糖水平、預(yù)防便秘和多種癌癥[7-9]和調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)等[10]。有研究表明，膳食纖維能夠有效增強(qiáng)2型糖尿病大鼠體內(nèi)抗氧化酶活性、提高機(jī)體清除氧自由基能力，并對(duì)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化具有明顯的抑制作用，從而表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用[12-13]，但鮮見(jiàn)膳食纖維對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺組織的保護(hù)及氧化損傷修復(fù)的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)糖尿病模型大鼠進(jìn)行了大豆膳食纖維對(duì)胰腺氧化損傷修復(fù)效果的研究，旨在為實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

雄性Wistar純系大鼠(許可證號(hào)：SCXK(吉)2016-0008)：長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司；大豆膳食纖維：國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心自制；鏈脲佐菌素：美國(guó)Sigma公司；優(yōu)降糖(格列苯脲片)：浙江嘉興生化制藥廠；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒：蘇州卡爾文生物技術(shù)有限公司；肝素鈉、二甲苯、無(wú)水乙醇、氨水、無(wú)水乙醚、蘇木精、伊紅染液：南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

血糖儀及及試紙；WD-2102A自動(dòng)酶標(biāo)儀；組織包埋盒；BT100-2J蠕動(dòng)泵；BS224S型電子天平；KD-BM生物組織包埋機(jī)；KD-P攤片機(jī)；KD-TS3A生物組織脫水機(jī)；RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)；CK40型光學(xué)顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆膳食纖維的提取

本實(shí)驗(yàn)中的大豆膳食纖維采用主要提取工藝流程[14]：

大豆豆渣→α-淀粉酶處理→糖化酶處理→蛋白酶處理→脫水、干燥、稱重→大豆膳食纖維粉

1.3.2 模型建立與飼養(yǎng)

健康Wistar雄性大鼠50只，體重(250±10) g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，稱重，按體重隨機(jī)抽取8只作為空白組，其余大鼠禁食12 h后，腹腔注射鏈脲佐菌素溶液(2%)(150 mg/kg)[14]，并恢復(fù)進(jìn)食，進(jìn)食72 h后，禁食12 h，空腹尾部靜脈取血測(cè)定其血糖值，選取空腹血糖值≥16.7 mmol/L的實(shí)驗(yàn)大鼠(40只)作為高血糖模型大鼠[15]。共分為5組，每組8只，組別為；模型組；對(duì)照組；大豆膳食纖維低、中、高劑量組。各劑量組大鼠具體藥劑分配見(jiàn)表1，連續(xù)灌胃42 d。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)專用塑料鼠籠，實(shí)驗(yàn)期間各組實(shí)驗(yàn)大鼠以基礎(chǔ)飼料飼喂(基礎(chǔ)飼料配比參考GB 14924.3-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》[16])，自由飲水，室溫環(huán)境(24±2)℃，相對(duì)濕度(45±3)%，光照12 h/d。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的藥劑分配

1.3.3 動(dòng)物指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間觀察實(shí)驗(yàn)大鼠日常行為狀況并記錄，末次給藥并禁食禁水24 h后，稱量大鼠體重并記錄。腹主動(dòng)脈取血法采血，部分血液樣本用以測(cè)量空腹血糖值，采用實(shí)驗(yàn)室試劑盒(酶標(biāo)法)測(cè)定SOD、GSH-Px、MDA含量。脊椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)大鼠后，取出大鼠胰腺組織稱重，并計(jì)算臟器比，并將其固定于10%甲醛溶液中，用以制作H&E染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織胰島區(qū)域病理學(xué)變化[17]。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行兩兩比較分析，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著，Origin軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大鼠體重指標(biāo)

各組大鼠體重指標(biāo)如圖1所示：糖尿病型大鼠建模成功后，體重指標(biāo)明顯下降，與空白組間存在極顯著差異(P<0.01)，經(jīng)灌胃不同劑量大豆膳食纖維及格列本脲后，除低劑量大豆膳食纖維組外，各灌胃組大鼠體重均較模型組升高，差異極顯著(P<0.01)。

注：*與模型組相比存在顯著差異(P<0.05)，**與模型組相比存在極顯著差異(P<0.01)。圖1 各組大鼠體重指標(biāo)

2.2 各組大鼠胰腺臟器比

臟器比即大鼠臟器濕重與大鼠體重的比值，可反映出糖尿病對(duì)各臟器的損傷情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘取各組大鼠胰腺稱量濕重并計(jì)算其臟器比(百分比)，結(jié)果見(jiàn)圖2。模型組大鼠胰腺體比與空白組大鼠相比顯著降低(P<0.05)，灌胃后，對(duì)照組及中、高劑量大豆膳食纖維灌胃劑量組大鼠胰腺體比較模型組大鼠均顯著升高，差異顯著(P<0.05)。

注：*與模型組相比存在顯著差異(P<0.05)，**與模型組相比存在極顯著差異(P<0.01)。圖2 各組大鼠胰腺/體比

2.3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)

各組大鼠血清GSH-Px、SOD及MDA含量如圖3所示：模型組大鼠較空白組大鼠血清GSH-Px及SOD含量降低，血清MDA含量升高，差異極顯著(P<0.01)。灌胃結(jié)束后，各灌胃劑量組大鼠血清GSH-Px及SOD含量均較模型組大鼠不同程度上升，血清SOD含量除低劑量大豆膳食纖維組較模型組差異顯著(P<0.05)外，中、高劑量大豆膳食纖維組大鼠血清SOD含量均較模型組大鼠上升，差異極顯著(P<0.01)。除低劑量大豆膳食纖維組外，對(duì)照組及中、高劑量大豆膳食纖維組大鼠血清GSH-Px含量均較模型組大鼠上升，差異極顯著(P<0.01)。血清MDA含量，對(duì)照組大鼠較模型組大鼠顯著下降，除低劑量大豆膳食纖維組外，中、高劑量大豆膳食纖維組大鼠血清MDA含量均較模型組大鼠下降，差異極顯著(P<0.01)。

注：*與模型組相比存在顯著差異(P<0.05)，**與模型組相比存在極顯著差異(P<0.01)。圖3 各組大鼠血清SOD、GSH-Px及MDA含量

2.4 各組大鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)變化

大鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖4?？瞻捉M大鼠的胰腺組織結(jié)構(gòu)及胰島細(xì)胞形態(tài)正常，胰島結(jié)構(gòu)完整細(xì)胞緊密，大小均一。模型組大鼠的胰腺組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，胰島結(jié)構(gòu)縮小，僅有少數(shù)細(xì)胞殘留，且細(xì)胞水腫變形，細(xì)胞間隙存在出血點(diǎn)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；灌胃后，與模型組大鼠相比，各灌胃劑量組大鼠胰腺組織損傷程度明顯減輕，胰島細(xì)胞數(shù)目增多，且細(xì)胞水腫變形程度減輕，細(xì)胞間隙偶有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。胰腺病理學(xué)切片結(jié)果表明，大豆膳食纖維可改善糖尿病對(duì)大鼠胰腺的損傷情況。

圖4 大鼠胰腺組織病理學(xué)觀察結(jié)果(×100)

3 討論與結(jié)論

大豆制品作為人們?nèi)粘Ｉ钪械某Ｒ?jiàn)食品，消耗量極大，而其生產(chǎn)加工后的大量豆渣，是難得的膳食纖維源。多糖是膳食纖維最主要的成分[18-19]，它是由一種或多種單糖分子縮合而成的一類生物大分子，廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁中[20]。大量研究表明，膳食纖維中的多糖組分能夠有效清除和猝滅機(jī)體內(nèi)多種來(lái)源的自由基，同時(shí)可提高體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性，且能夠抑制并減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的生成[21-22]。

目前有相關(guān)研究結(jié)果表明，2型糖尿病患者體內(nèi)氧自由基增多，導(dǎo)致體內(nèi)葡萄糖無(wú)法充分氧化分解，進(jìn)而造成胰腺氧化應(yīng)激損傷，胰島β細(xì)胞受損，胰島素分泌減少[23]。氧自由基可對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞膜、線粒體及DNA等功能結(jié)構(gòu)造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生突變，衰老甚至死亡[24]。另外，機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷現(xiàn)象又可以直接影響胰島β細(xì)胞生理活性，降低靶向細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，并誘導(dǎo)活性氧簇(ROS)大量積累，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，生成MDA[25-26]。丙二醛(MDA)是隨著脂質(zhì)在細(xì)胞中的堆積，由酶系統(tǒng)或非酶系統(tǒng)所產(chǎn)生的自由基氧化產(chǎn)物，它含量的高低是血管內(nèi)皮細(xì)胞受損程度的重要指標(biāo)，含量高則受損程度大，含量低則受損程度小[27]。本實(shí)驗(yàn)中的糖尿病模型大鼠灌胃42 d后，各膳食纖維劑量組大鼠血清中MDA含量均明顯低于模型組大鼠，證明大豆膳食纖維能夠顯著降低體內(nèi)MDA濃度，抑制糖尿病對(duì)胰腺的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度。

SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能有效清除氧自由基，降低或阻止其對(duì)機(jī)體細(xì)胞和組織的損害[28]。而GSH-Px是機(jī)體廣泛存在的一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶，它能特異催化還原型谷胱甘肽過(guò)氧化氫進(jìn)行還原反應(yīng)，清除體內(nèi)低分子自由基、過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化物等，進(jìn)而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，減少氧自由基對(duì)機(jī)體細(xì)胞或組織的損傷[29]。因此血清中SOD和GSH-Px是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力的重要指標(biāo)[30]。灌胃結(jié)束后，其血清中SOD和GSH-Px的含量與模型組相比，均有顯著升高，中、高劑量組差異極顯著(P<0.01)，證明大豆膳食纖維可以有效提高體內(nèi)SOD和GSH-Px含量，增強(qiáng)機(jī)體的自由基清除能力。Hamden K等[31]和Ikegami S等[32]的相關(guān)研究表明，膳食纖維對(duì)大鼠胰腺組織具有良好的保護(hù)和修復(fù)作用。本實(shí)驗(yàn)中胰腺組織病理學(xué)切片觀察結(jié)果顯示，各大豆膳食纖維劑量組大鼠胰腺組織胰島細(xì)胞減少、細(xì)胞水腫變形、細(xì)胞間隙存在出血點(diǎn)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象具有顯著改善，研究結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道一致，證明大豆膳食纖維能夠修復(fù)糖尿病造成的大鼠胰腺氧化損傷。

綜上所述，大豆膳食纖維能夠通過(guò)組分中多糖的直接作用和提高體內(nèi)抗氧化活性酶的間接作用，達(dá)到對(duì)抑制并修復(fù)胰腺組織氧化損傷的效果。