輻射誘變及其在大豆育種中的應(yīng)用

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(1.中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 大豆分子設(shè)計育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081；2.中國科學院大學，北京100049)

0 引 言

大豆(Glycinemax)原產(chǎn)于中國，距今已經(jīng)有五千年的栽培歷史[1]，是一種重要的糧油兼用作物[2]。根據(jù)FAO/IAEA的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2016年世界大豆年總產(chǎn)量已經(jīng)達到1961年的12倍左右，但同比世界其他主產(chǎn)作物的單產(chǎn)增加幅度，大豆單產(chǎn)僅增加了2.4倍左右[3]，這說明世界范圍內(nèi)，目前增加大豆總產(chǎn)量的方式仍主要是擴大種植面積。然而，世界耕地資源有限，人口又不斷增長，如何利用有限的種植面積，提高大豆的單產(chǎn)水平，培育高產(chǎn)且優(yōu)質(zhì)的大豆品種，滿足人類對大豆產(chǎn)品的需求，是大豆育種工作所面臨的一個挑戰(zhàn)。

大豆是嚴格的自花授粉作物，天然異交率不到1%，因此，大豆育種中最常用的方法是雜交育種。在我國，利用雜交育種方法培育的大豆品種占已經(jīng)育成的品種的88.16%[4]。但是，雜交育種具有育種周期長，可利用的突變類型和可創(chuàng)造的新的變異類型有限等不足，很難滿足育種的實際需求。而輻射誘變育種因其具有突變率高，突變譜廣，育種年限短等優(yōu)點，在大豆育種中也被廣泛應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計，1962-2011年間，世界范圍內(nèi)，應(yīng)用誘變育種技術(shù)共育成大豆品種175個，其中122個應(yīng)用了輻射誘變育種技術(shù)[5]。本文從輻射誘變育種的原理，大豆輻射誘變的生物學效應(yīng)，誘變后代的篩選方法和誘變后代主要變異類型4個方面，總結(jié)了國內(nèi)外在大豆輻射誘變育種方面的研究進展，討論分析了大豆輻射誘變育種工作中的難點，提出了輻射育種及其技術(shù)今后需要加強的幾個方面，以期明確輻射誘變的作用機理，推進輻射誘變在大豆品種選育中的廣泛應(yīng)用。

1 輻射誘變育種的原理

19世紀中期，孟德爾發(fā)現(xiàn)了分離定律和自由組合定律，使遺傳學成為了植物育種中一門重要的學科，雜交理論建立后植物育種進一步發(fā)展，誘變育種也隨之發(fā)展[6]。輻射誘變育種是利用物理因素誘發(fā)植物產(chǎn)生遺傳突變，從而在短時間內(nèi)獲得有價值的突變體，供生產(chǎn)研究或進行新的種質(zhì)資源的培育的一種育種方法[7]。其原理是，放射源所放射的快速運動的帶電粒子在通過植物體時，會與其發(fā)生能量的轉(zhuǎn)移和交換，產(chǎn)生一系列的正負離子或激發(fā)態(tài)原子，這些離子或原子會影響到細胞內(nèi)的部分生化反應(yīng)，誘導植物細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，從而引發(fā)突變[8]。最早進行輻射誘變育種的是美國科學家Stadler，他在1928年首次證實了X射線對大麥具有誘導效應(yīng)[9]。

大豆輻射誘變育種開始于20世紀30年代，第一個進行大豆誘變育種的是蘇聯(lián)的科學家列什干科，他以X射線為誘變源處理大豆種子和已經(jīng)開花的植株，獲得了很多類型的變異[10]。γ射線、X射線、中子、激光和重離子是大豆輻射誘變育種中最常用的誘變源。由于γ射線波長較短，相比于X射線和中子具有更好的穿透力，所以應(yīng)用最為廣泛。中子危險性較高且穿透能力較差，但是誘導DNA產(chǎn)生大片段缺失比較有效。重離子束是一種新型誘變劑，相比于其他誘變源，重離子具有較高的傳能線密度(Linear Energy Transfer，簡稱LET)，可以在較高的存活率下獲得較高的突變率，引起更為顯著的生物學效應(yīng)[11]。激光是利用自身多種能量的綜合作用，使DNA在吸收能量后進行能量分配的過程中，發(fā)生分子結(jié)構(gòu)的改變而引發(fā)突變[12]。每種方法都有相對的優(yōu)勢和不足，育種中要根據(jù)育種目標和其他條件的限制進行綜合選擇。

2 大豆輻射誘變生物學效應(yīng)研究

2.1 表型水平的變化

研究表明，由于輻射對種子造成的生理損傷，在M1代，出苗時間和成熟時間會出現(xiàn)一定程度的延長，出苗率相比對照明顯降低，且輻射劑量越大，出苗率越低。而且，隨著植株的生長，很多性狀會出現(xiàn)一定的變化，如生長緩慢，發(fā)育畸形，葉片黃化，卷曲皺縮等，植株的株高、節(jié)數(shù)、分枝數(shù)及莢數(shù)等也會出現(xiàn)一定變化，同時也會出現(xiàn)雙主莖、不育株和半不育株等，很多植株不能正常生長而死亡，植株成活率下降[13-17]。M1代植株性狀的很多改變都是由于生理損傷產(chǎn)生的，所以不會遺傳給下一代，有很多隱性突變也不會在M1代顯現(xiàn)出來。在M2代，生理損傷和畸形都會有所恢復，會分離出大量的突變，是篩選突變體的重要世代[18]，但是，很多突變都是無益突變，出現(xiàn)生育期和葉綠素的變異概率較高，在生育期方面甚至會出現(xiàn)極早到極晚的連續(xù)變異，變化幅度在5～30 d左右[19]。M3代，一般對M2代選定的候選突變體進行進一步的篩選確定，所篩選出來的突變體再經(jīng)M4代種植并結(jié)合一些其他方法進一步確認，基本可確定穩(wěn)定遺傳。因為表型的變化最易于觀察和篩選，所以研究比較廣泛，利用輻射誘變技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了葉形突變體[20]、子葉折疊突變體[21]、矮化短柄突變體[22]、種皮不完整突變體[23]，早熟高產(chǎn)突變體和種皮顏色突變體[24]等，見圖1。近年來，也有很多研究學者應(yīng)用輻射誘變育種技術(shù)在表型水平構(gòu)建了大豆的突變體庫，在生育期，葉部性狀、株型、育性、種皮顏色、蛋白質(zhì)和油分含量方面發(fā)現(xiàn)了眾多的變異材料，為相關(guān)研究提供了豐富的種質(zhì)資源[25-26]。

注：左上 葉形突變體[20]；右上 種皮不完整突變體[23]；左下 早熟高產(chǎn)突變體[24]；右下 種皮顏色突變體[24]。Note:Top left: Leaf shape mutant;Top right: Incomplete seed coat mutant;Lower left:Earlier maturity,high yield mutant; Lower right: Seed-coat color change mutant.圖1 部分大豆突變體與其原始品種不同的農(nóng)藝性狀比較[20,23-24]Fig.1 Comparisons of different agronomic traits between soybean mutant cultivars and their original cultivars[20,23-24]

2.2 生理水平的變化

在生理生化方面，輻射會打破植物體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，導致自由基增多，進而引發(fā)植物體內(nèi)抗氧化酶系、激素及微量元素等一系列復雜的反應(yīng)[27]。不同品種以及不同輻射處理的生理變化規(guī)律不盡相同。在燕麥[28]、普那菊[29]、甜高粱[30]、小麥[31-32]及煙草[33]等作物中的相關(guān)研究均表明，隨著輻射劑量的增加，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)及過氧化氫酶(CAT)等酶活性均有所升高，但當輻射劑量增加到一定數(shù)值后會出現(xiàn)降低的情況，這可能是由于輻射對植物造成的損傷過大，植物無法進行自身修復的緣故。

有關(guān)大豆這方面的研究并不是很多。Alikamanoglu等研究表明，隨著輻射劑量的增加，大豆植株的Fe、Cu、Zn、可溶性蛋白和丙二醛(MDA)的含量逐漸增加，SOD和POD的活性明顯升高[34]。Tewari等設(shè)置250 Gy、500 Gy和1 000 Gy 3個γ射線輻射劑量，輻射4個不同種皮顏色的大豆品種，發(fā)現(xiàn)黑色種皮的大豆對γ射線輻射較為敏感，豆腥味也因輻射得到了明顯的改善，但是，SOD和CAT等酶活性卻隨著輻射劑量的升高而降低[35]，這與Alikamanoglu的研究結(jié)果不一致，這可能是因為輻射劑量率或者品種不同造成的。Moussa研究表明，在播種前用較低劑量(20 Gy，0.54 Gy·min-1)的γ射線輻射大豆種子，可以提高植物的抗旱性，且不論在干旱還是在水分充足的條件下，經(jīng)過輻射處理的種子的植株其MDA含量和SOD、POD和CAT等酶活性均有所升高[36]。這些生理指標反應(yīng)了植物體內(nèi)由于輻射誘變造成損傷的程度，或許可以在將來的研究中作為最佳輻射劑量的篩選依據(jù)。

2.3 分子水平的變化

在分子水平方面，輻射可以引起DNA發(fā)生多種類型的損傷，包括堿基與核糖變化，鏈斷裂和與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)等。最常見的是DNA鏈的斷裂，而鏈的斷裂與誘變源的傳能線密度(LET)密切相關(guān)。一般來說，隨著LET的增大，單鏈斷裂(SSB)減少，雙鏈斷裂(DSB)增多[37]。而為了保持遺傳的穩(wěn)定性，生物體內(nèi)普遍存在著DNA的損傷修復機制，以消除或減輕DNA的損傷[38]。所以，育種中理想的誘變源，應(yīng)該既可以使DNA分子發(fā)生多種類型的損傷，又可以保證相對較低的被修復率。輻射誘變所獲得的突變體，一方面可以作為優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源，另一方面也可以作為大豆相關(guān)基因功能研究的原始材料。

大豆是由古四倍體演化而來的二倍體作物[39]，大豆基因組已于2010年在Nature雜志上正式發(fā)表公布[40]，利用大豆的基因組信息，已經(jīng)成功克隆了調(diào)控大豆生育期、生長習性、種子形態(tài)和組分、結(jié)瘤和養(yǎng)分利用效率、生物以及非生物脅迫抗性等重要農(nóng)藝性狀的功能基因，也初步揭示了相關(guān)的作用機理[41]。這些研究，為充分利用輻射誘變進一步挖掘相關(guān)的QTL和基因功能網(wǎng)絡(luò)在大豆產(chǎn)量和品質(zhì)形成中的作用提供了基礎(chǔ)證據(jù)，也為輻射誘變精確鑒定突變體和精準培育目標性狀品種，奠定了分子基礎(chǔ)。

3 大豆輻射誘變后代選育方法研究

大豆輻射誘變育種中最常用的處理材料是種子，通常選擇半致死劑量。也有相關(guān)研究認為，致死率應(yīng)該更低，這樣更有利于自交后代的繁殖[11]。研究認為，針對不同的目標性狀應(yīng)選擇不同的輻射處理方式和處理劑量。Tanhindarto等研究表明，較低劑量率的照射更有利于大豆異黃酮性狀的改良[42]。Patil等研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的γ射線和較高濃度的EMS復合誘變處理更有利于大豆脂肪酸性狀的改良[43]。對于最佳輻射劑量的確定方法，由于不同品種對不同的輻射誘變源的響應(yīng)存在很大差異，一直沒有明確的標準。輻射劑量過高會導致處理當代植株的大量死亡，輻射劑量過低又不利于變異的產(chǎn)生。李多芳等建立了電離輻射致植物誘變效應(yīng)的損傷-修復模型，該研究表明，電離輻射植物存活率-劑量呈馬鞍型曲線關(guān)系，并且對于電離輻射植物誘變效應(yīng)而言，可能存在多個最適劑量[44]。

因為輻射后代的有益突變率極低，而且要同時考慮育種需求并受到試驗規(guī)模的限制，因此一次處理種子的量應(yīng)該在500～2 000粒左右[45]。針對不同的樣本數(shù)量和不同的育種需求，后代選育的方法也有所不同。谷秀芝等認為，系譜法穩(wěn)定較快，一莢傳法和摘優(yōu)株莢法相對節(jié)省人力物力[46]。Patil等設(shè)置了19個輻射處理，共計19 000粒種子，采取M1代每株收5粒，并對M1代的收獲物按照組合進行脂肪酸組成的初步鑒定，保留有明顯變異的處理進行種植，M3代、M4代每株收獲10粒進行性狀是否穩(wěn)定遺傳的鑒定，最后篩選出高亞油酸、低亞麻油酸且其他品質(zhì)性狀不受影響的突變體[43]。這種篩選方法可能在M1代丟失部分目標性狀，但對于樣本數(shù)量過大且育種目標性狀明確的情況，此種方法具有很好的借鑒意義。對于目標性狀不明確的情況，可以參考尚娜[47]的研究方法，即在M1代不加選擇，單株收獲；在M2代種植成株行，田間觀察，并按照一定的標準對突變體進行明確分類；M3代按分類進行小區(qū)種植，篩選表型穩(wěn)定一致的突變體，進行分子標記，從分子水平對突變體進行鑒定，并進行后續(xù)的基因功能分析鑒定和突變體的擴繁推廣等工作。此種方法最大程度的保留了可能的變異，并減少了篩選過程的工作量，但明確的分類標準的確定是本方法的一個難點。Arase等在M1代對最佳輻射劑量進行初步篩選，認為12C重離子輻射的條件下，劑量率320-MeV、2.5～5.0 Gy的輻射范圍，既可以產(chǎn)生有效的變異又可以保證群體的存活數(shù)量，適合進行大豆誘變育種和突變體基因功能鑒定的相關(guān)研究，并利用此條件篩選出了葉綠素缺失突變體[48]。此種方法需要首先明確最適的輻射范圍，方可有效地減少后代選擇的工作量。

4 大豆輻射誘變后代主要突變類型

我國作物種質(zhì)資源庫中現(xiàn)存大豆種質(zhì)資源2.3萬余份,是世界上收集和保存大豆種質(zhì)資源數(shù)量最多的國家[49]。這些種質(zhì)資源具有多種類型的變異，其中百粒重的變異在1.8～46.0 g之間；品質(zhì)方面，蛋白質(zhì)的變異在29.3%～52.9%，其中含硫氨基酸的含量在2.0%～4.3%之間，脂肪的變異在10.7%～25.3%之間，其中亞麻酸的含量在4.2%～17.7%之間。除此之外，還篩選出對孢囊線蟲病和銹病的抗性性狀，同時也篩選出很多耐鹽、耐冷和抗旱等一些高抗高耐的種質(zhì)資源。

4.1 品質(zhì)方面的變異

蛋白質(zhì)和脂肪含量的多少是衡量大豆品質(zhì)好壞的關(guān)鍵。大豆蛋白是一種含有8種人體必需的氨基酸的優(yōu)質(zhì)蛋白，但是含硫氨基酸的含量卻較低；大豆脂肪最主要的營養(yǎng)成分是油酸和亞油酸，其中高度不飽和亞麻酸的存在，導致大豆油的穩(wěn)定性和耐貯性降低,嚴重影響豆奶的商品價值，并使豆制品易被氧化變質(zhì)。而且研究顯示，大豆中的蛋白質(zhì)含量和脂肪含量呈負相關(guān)關(guān)系，因此，為了提高大豆的營養(yǎng)價值、加工品質(zhì)及氧化穩(wěn)定性，大豆品質(zhì)育種的綜合目標是選育含有較高含量的蛋白質(zhì)、脂肪和硫氨基酸及低亞麻酸含量的大豆[50]。但是傳統(tǒng)的育種方法很難選出多個指標均為優(yōu)良的品種，而誘變育種就可以打破這種限制，彌補傳統(tǒng)育種的不足。黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大豆所利用60Coγ射線、X射線和熱中子等進行誘變處理，結(jié)合有性雜交，選育出黑農(nóng)4號等13個系列優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的大豆品種，其中，黑農(nóng)32大豆品種蛋白質(zhì)與脂肪總和超過64%[51]。李雪華對60Coγ射線輻射的12個品種的3 000多份M3代家系進行篩選，篩選出大豆高蛋白和低蛋白含量、高油分和低油分含量的家系各200份，并擴繁至M4代，發(fā)現(xiàn)M4代的蛋白質(zhì)含量或油分含量，與對照和M3代相比較，差異均達到顯著水平[52]。安徽農(nóng)業(yè)大學采用Ne激光輻射，育成的安激 2號，具有高產(chǎn)、高蛋白質(zhì)和高脂肪等優(yōu)良性狀，同時該品種還抗花葉病毒和孢囊線蟲病，已經(jīng)被大面積推廣[12]。Bolon等建立了快中子誘變大豆突變體庫，并發(fā)現(xiàn)在多代中表現(xiàn)出種子蛋白質(zhì)和脂肪含量顯著增加或減少的突變體，蛋白質(zhì)和脂肪的總含量在53.8%～65.8%之間[53]。

4.2 產(chǎn)量性狀的變異

產(chǎn)量是育種中最重要的性狀，但是產(chǎn)量是一個極其復雜的數(shù)量性狀，一般育種中選擇與產(chǎn)量相關(guān)的因子進行改良，如單株莢數(shù)、單株粒數(shù)及百粒重等，但也有研究認為大豆品種超高產(chǎn)性狀主要與生物量、表觀收獲指數(shù)、生育期及花莢脫落等性狀有關(guān)[54]。應(yīng)用輻射誘變育種改善大豆產(chǎn)量性狀的優(yōu)勢在于輻射誘變可以同時改良多個性狀，達到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的育種目標。翁秀英等早在1966年就用X射線照射滿金倉的后代，獲得了一系列優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)且具有不同適應(yīng)性的品種[55]。鹿文成等利用雜交育種和輻射誘變育種相結(jié)合的方法，選育出比對照增產(chǎn)8.5%的黑河52，該品種還同時具有早熟、稈強及不炸莢等優(yōu)良性狀[56]。韓國育種者Lee等在γ射線250 Gy輻照的條件下，選育出Bangsakong和Josaengseori兩個高產(chǎn)品種，相比原品種分別增產(chǎn)15%和142%，但是百粒重卻反而降低[24]。Meng等以激光為誘變源，將培育的大豆品種單產(chǎn)提高了30%[57]。由以上研究成果可以看出，輻射誘變育種技術(shù)可以在大豆產(chǎn)量性狀改良方面獲得較好的效果，但是目前只能結(jié)合一些明顯的與產(chǎn)量相關(guān)的表型性狀進行選擇，如何能更有效地在早期世代選擇出高產(chǎn)的突變是一個難點。

4.3 抗性性狀的變異

抗性包括抗病和抗逆(寒、旱、鹽、堿等)?？共⊥蛔兪亲铍y誘發(fā)的突變類型，一方面，抗病性狀的變異率極低，例如，γ射線誘變得到的大豆抗銹病突變率僅為8.3×10-6[58]；另一方面，抗病性狀的篩選過程工作量大，且操作困難，而且出現(xiàn)嵌合體的概率高，后代分離時間較長，很難形成穩(wěn)定的突變體[59]。所以，在大豆抗病性狀改良的研究中，通常采用輻射誘變技術(shù)和雜交育種技術(shù)相結(jié)合的方法，并已經(jīng)育成了同時抗灰斑病和病毒病的大豆品種合豐33號[60]、抗灰斑病的牡豐6號[61]及抗花葉病毒的誘變30[62]等。在抗逆性方面，一般在大田實驗中，抗逆性的篩選方法和評價指標很難有明確的標準，很多時候需要人為的創(chuàng)造相關(guān)的逆境條件，且輻射誘變育種需要逐代擴繁，這也給篩選和鑒定的工作帶來很大的難度，尚沒有通過輻射誘變育種育成相關(guān)抗逆性的品種的報道。理論上講，輻射誘變應(yīng)該在創(chuàng)制抗逆大豆種質(zhì)突變體和抗逆品種的選育過程中，起到了促進作用，然而，目前尚無相關(guān)的研究證據(jù)。

5 輻射誘變育種需要加強的幾個方面

5.1 輻射損傷機理的研究

輻射和寒害、旱害、低溫及高溫等一樣也可以稱之為是一種逆境，雖然研究表明輻射同其他眾多逆境條件一樣在M1代會引起關(guān)鍵酶(SOD、POD和CAT等)、激素和代謝產(chǎn)物(MDA等)的規(guī)律性變化，但是輻射損傷引起這些變化的具體調(diào)節(jié)機制尚不明確。同時，多項研究表明，大豆中的異黃酮皂苷等物質(zhì)因具有抗氧化和抗自由基的功能，因而可能具有抗輻射效應(yīng)[63]。那么大豆對于輻射的響應(yīng)是否會因為這兩種輻射防護物質(zhì)的存在而不同于其他的植物，都有待于深入探討。

5.2 重離子誘變劑的利用及其作用機理

重離子作為一種新型的誘變源，相對于其他誘變源具有更高的LET和更高的相對生物學效應(yīng)(Relative Biological Effectiveness，簡稱RBE)，可以主要引發(fā)單鏈斷裂、雙鏈斷裂等多種類型的變異，且被修復率很低，因而可以獲得較高的突變率和較寬的突變譜[64]，在國內(nèi)外很多植物育種中都有應(yīng)用和研究[65]。然而，重離子在大豆輻射育種中的應(yīng)用研究較少，尚沒有通過重離子育成大豆品種的相關(guān)報道。張秋英等研究認為，重離子輻射輻射劑量應(yīng)以100 Gy以下為宜[15]；余麗霞等通過重離子輻射，發(fā)現(xiàn)了可以在M2代穩(wěn)定遺傳的褐皮突變體[14]。無疑，這些開創(chuàng)性的工作為重離子輻射在大豆育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，而深入解析適宜劑量以及由此產(chǎn)生的表型變化的生理分子機制，將為作物輻射育種增加新的知識，并有助于加快重離子輻射培育大豆新品種的進程。

5.3 空間誘變育種機理

我國于1978年開始航天育種，目前已經(jīng)取得了階段性進展，已有4個大豆品種已經(jīng)通過了國家級或省級審定，其中克山1號為早熟高油品種，金源為早熟高蛋白品種[66]。但是，目前關(guān)于空間誘變育種技術(shù)的原理和方法等尚不完善。比如，如何選擇誘變材料，如何保留隱性突變材料，確保突變系群的完整性以進行后代的篩選？而且，空間誘變后代性狀突變效應(yīng)的遺傳研究尚處于探索階段[67]。這些問題的解決和遺傳變異機理的揭示，將有助于更好地發(fā)掘優(yōu)良變異，提高有益變異的利用率，進而推動其在大豆育種中的應(yīng)用。

5.4 與其他育種方法的結(jié)合

近年來，分子育種技術(shù)及基因編輯育種技術(shù)蓬勃發(fā)展，很大程度地改善了育種中的盲目性。輻射誘變育種因其可以提供新的變異類型，仍具有其他育種技術(shù)無法替代的優(yōu)勢，所以仍是大豆育種中一種必不可少的方法。但是育種工作者應(yīng)注重將輻射誘變育種、雜交育種和分子育種進行更好地結(jié)合，這樣一方面可以更好地發(fā)揮輻射誘變育種的優(yōu)勢，另一方面，也可以更高效地進行突變體的篩選，有效減少突變體篩選過程中的人力物力，并且可以發(fā)現(xiàn)一些肉眼不易鑒別的突變體。