蟲草米發(fā)酵條件優(yōu)化及體內(nèi)抗衰老活性分析

朱振元，于曉鳳，賈長英，冀英萍

蛹蟲草（Cordyceps militaris (L.)）又名為北冬蟲夏草，隸屬于真菌界、子囊菌亞門（Ascomycotina）、核菌綱（Pyrenomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲草屬（Cordyceps），是蟲草屬的模式種[1]。其寄主主要是蟲草蝙蝠蛾和鞘翅目等幼蟲及昆蟲蛹體[2-3]。蛹蟲草具有多種藥理功效，其主要功效成分有蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutas，SOD）、黃酮類、麥角甾醇等[4-5]，其種類和含量在一定程度上決定了蛹蟲草具有抗癌、抗病毒、抗疲勞、抑制炎癥、免疫調(diào)節(jié)、降糖降脂和護肝等功效[6-9]。大米是日常生活中常生活中的主食之一。以大米為培養(yǎng)基發(fā)酵蟲草具有很大的營養(yǎng)價值，但目前相關(guān)研究不是很多。樸美子等[10]將蟲草菌絲體加入以大米為基質(zhì)的固體培養(yǎng)基，發(fā)酵得到含有蟲草功能性成分的蟲草米，并證明其具有一定免疫活性。本實驗組前期[11]以大米為培養(yǎng)基，對蟲草發(fā)酵前后的營養(yǎng)和功能成分變化及體外抗氧化活性進行了研究。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，對蟲草米發(fā)酵條件優(yōu)化及其發(fā)酵產(chǎn)物的體內(nèi)抗衰老作用進行研究，旨在為進一步開發(fā)利用蟲草米提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米為市售；蛹蟲草菌種為天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院生物資源與功能性食品實驗室提供，菌株標(biāo)號為ZZYYS。

野生型Oregon K品系黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）由天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品添加劑與營養(yǎng)調(diào)控研究室提供。

3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蟲草酸 北京索萊寶科技有限公司；高碘酸鉀、乙酸銨、L-鼠李糖、乙腈 天津市江天化工技術(shù)有限公司；α-淀粉酶 天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；SOD試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

JR-2集熱式磁力加熱攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司；TGL-16B臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；HS3120超聲儀 上海雷勃分析儀器有限公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SP-2102UV紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；HYG-IIa回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；LC-10ATVP高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 蟲草米發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.1.1 接種及培養(yǎng)

將蛹蟲草斜面菌種接種到PDA培養(yǎng)基[12-13]中進行活化后，用接種針取約1.0 cm2的蛹蟲草斜面菌種于種子培養(yǎng)基，22 ℃培養(yǎng)3 d[14]。在無菌操作臺中以10%的接種量將種子液接至基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于150 r/min的恒溫搖床中，22 ℃培養(yǎng)4 d[11]。

稱取30 g大米裝入錐形瓶中，加一定比例的蒸餾水浸泡1 h左右，121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻。在無菌操作臺中接入一定體積的液體菌種，放入一定溫度及濕度的培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)，空氣為60%，至菌絲吃透固體養(yǎng)料，暗發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)瓶長滿菌絲后，將其放于200 lx的散射光環(huán)境中，每天光照12 h促進轉(zhuǎn)色，濕度保持不變，約1 周后，白色菌絲轉(zhuǎn)為橘黃色，轉(zhuǎn)色結(jié)束[15]。

1.3.1.2 蟲草米發(fā)酵單因素試驗與正交試驗

選擇料水比、接種量（以大米干基為基準(zhǔn)）、發(fā)酵溫度及避光發(fā)酵時間為試驗對象，保持其他條件不變，22 ℃培養(yǎng)9 d，為分別測定在不同水平下蟲草米中蟲草酸、水溶性非淀粉多糖（water-soluble nonstarch polysaccharides，SNSP）含量，設(shè)3 組平行試驗，測其平均值。在單因素試驗基礎(chǔ)上確定正交試驗各因素的范圍，以正交試驗（表1）確定蟲草米發(fā)酵條件的最佳條件。

1.3.2 蟲草素含量測定

1.3.2.1 蟲草素的提取

蟲草米粉1.000 0 g，加入蒸餾水40 mL，超聲功率100 W，于60 ℃提取50 min，在4 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，重復(fù)操作3 次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一定體積，蒸餾水定容到100 mL。將溶液稀釋到合適濃度，過0.45 μm濾膜后進行高效液相色譜檢測。

1.3.2.2 測定條件

選用高效液相色譜法測定蟲草米中的蟲草素含量[16]。色譜條件：色譜柱采用C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水體積比15∶85，檢測波長259 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 蟲草米體內(nèi)抗衰老實驗

在前人研究的基礎(chǔ)上稍作改進[17-18]，分別配制兩種果蠅培養(yǎng)基。果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米粉72 g，無水葡萄糖72 g，干酵母粉10 g，瓊脂粉6 g，防腐劑（含1%對羥基苯甲酸乙酯的75%乙醇液）40 mL及蒸餾水750 mL；實驗組培養(yǎng)基：分別將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中25%、50%、75%的玉米粉替換成相應(yīng)質(zhì)量的蟲草米粉，另將50%的玉米粉替換成相應(yīng)質(zhì)量的大米粉作為大米對照組。

1.3.3.1 果蠅壽命實驗

收集3 d內(nèi)羽化的雌雄果蠅各1 000 只，隨機分為5 組雄果蠅及5 組雌果蠅，雌雄組分別設(shè)空白對照組、大米對照組、蟲草米低劑量組、中劑量組及高劑量組。每組10 個培養(yǎng)管，每管20 只果蠅[19]。放于25 ℃、相對濕度60%左右的濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換新鮮培養(yǎng)基，記錄果蠅死亡數(shù)目直至全部果蠅死亡，計算果蠅半數(shù)死亡期（每組中半數(shù)果蠅死亡的平均時間），最高壽命（即每組中最后死亡的20 只果蠅存活時間的平均數(shù)）及平均壽命（每組全部果蠅死亡時間的平均數(shù)）。實驗過程中因過度麻醉、轉(zhuǎn)管時飛走、培養(yǎng)基黏住等偶然因素死亡的果蠅數(shù)目不計。

1.3.3.2 果蠅抗氧化酶活性實驗

由上述果蠅壽命實驗方法收集雌雄果蠅各1 000 只，以上述方法分別將雌雄果蠅分成5 組，飼養(yǎng)果蠅至40 d時，各收集一半的果蠅，使其餓2 h，用氮氣致暈，稱質(zhì)量，按1∶49（mg/mL）比例加生理鹽水，冰浴條件下勻漿，得到2%的果蠅組織勻漿液，隨后在4 ℃條件下2 500 r/min離心10 min，取上清液[20-21]。測定各管組織液的總蛋白含量[22]，按照試劑盒中說明書指示的方法分別測各管總SOD活力（黃嘌呤氧化酶法）、CAT活力（紫外分光光度法）以及脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)物MDA含量（硫代巴比妥酸法），SOD和CAT活性以相對酶活力表示，單位為U/mg，MDA含量用1 mg蛋白中的物質(zhì)的量表示，單位為nmol/mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草米發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 料水比的選擇

圖1 料水比對蟲草酸和SNSP含量的影響Fig. 1 Effect of material to water ratio on the contents of cordycepic acid and SNSP

固體培養(yǎng)基中，料水比關(guān)系到菌種生長環(huán)境的濕度。料液比過高與過低，都會影響到菌絲體的生長代謝[23]，進而影響固體基質(zhì)中蟲草酸和SNSP的積累。如圖1所示，料水比對蟲草酸和SNSP的影響趨勢較一致，隨著溶劑用量增加，蟲草米中蟲草酸及SNSP含量均呈先升高后下降趨勢，料水比為1∶1.0，兩種成分含量均達到最高值，分別為11.55 mg/g、7.42%，溶劑用量過低時大米固體培養(yǎng)基較干，不適合菌種發(fā)酵[24]；溶劑用量過高則大米黏性較大，易結(jié)塊，透氣性差，使菌絲體的供氧量降低，菌絲體只在表面生長，難以滲透到基質(zhì)內(nèi)部，導(dǎo)致發(fā)酵不徹底。

2.1.2 接種量的選擇

圖2 接種量對蟲草酸與SNSP含量的影響Fig. 2 Effect of inoculum concentration on the contents of cordycepic acid and SNSP

接種量的多少直接影響了菌種在發(fā)酵基質(zhì)中的生長快慢[25-26]。接種量過少，菌絲體發(fā)酵慢，生產(chǎn)效率降低；接種量增加，菌絲體的生長速率加快，且降低染菌風(fēng)險，但接種量過高會導(dǎo)致發(fā)酵進程中產(chǎn)生的代謝廢物增加，影響到其他代謝物的產(chǎn)生[27-28]。如圖2所示，隨著接種量增大，蟲草米中蟲草酸和SNSP含量升高，接種量為20 mL/100 g時，兩種成分分別高達17.12 mg/g、7.76%，接種量繼續(xù)增加兩種成分含量反而降低，可能是由于接種量過大，菌絲開始生長較快，容易在基質(zhì)表面形成菌膜導(dǎo)致內(nèi)部菌絲生長受限[29]。

2.1.3 發(fā)酵溫度的選擇

圖3 發(fā)酵溫度對蟲草酸與SNSP含量的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on the contents of cordycepic acid and SNSP

蛹蟲草菌種在中低溫的環(huán)境下生長適宜，自然條件下，20 ℃左右促使其萌發(fā)，溫度過高影響蟲草正常生長代謝活動，而在過低的環(huán)境中，不利于菌絲體的形成及活性組分的產(chǎn)生[30]。圖3表明，培養(yǎng)溫度在18～22 ℃期間，蟲草酸及SNSP含量隨著溫度的升高逐漸增加，22 ℃左右達到最高值，分別為17.07 mg/g、7.79%。24 ℃時與22 ℃條件下差別不太明顯，但溫度繼續(xù)上升到26 ℃時，兩種成分含量均明顯下降。說明在一定范圍內(nèi)，溫度升高，蟲草菌活性增強，超過菌種最適宜溫度，菌種體內(nèi)酶活性降低[31]，代謝速率減慢，兩種物質(zhì)含量隨之減少。

2.1.4 避光發(fā)酵時間的選擇

圖4 避光發(fā)酵時間對蟲草酸與SNSP含量的影響Fig. 4 Effects of fermentation time on the contents of cordycepic acid and SNSP

菌種避光發(fā)酵時間的長短，影響菌種代謝活性，關(guān)系著發(fā)酵產(chǎn)物的多少[32]。在一定時間內(nèi)，代謝產(chǎn)物隨避光發(fā)酵時間的延長而不斷積累，但時間過長，代謝產(chǎn)物不僅積累速度降低，而且可能伴隨著代謝產(chǎn)物的分解，給生產(chǎn)帶來不利，所以，要嚴(yán)格控制避光發(fā)酵時間。如圖4所示，蟲草酸含量在發(fā)酵8～9 d時含量達到最高值，而SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵9～10 d時最高，兩者均隨著時間延長先增加后降低，均在發(fā)酵9 d左右時產(chǎn)量較高，最高分別可達到17.87 mg/g、7.91%。避光發(fā)酵時間延長，菌絲老化的情況明顯，相關(guān)酶活降低，兩種功能成分的含量出現(xiàn)降低現(xiàn)象。

2.1.5 蟲草米發(fā)酵正交試驗結(jié)果

表2 發(fā)酵正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with response variables

表3 蟲草酸含量的方差分析Table 3 Analysis of variance for the effect of fermentation conditions on cordycepic acid content

表4 SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方差分析Table 4 Analysis of variance for the effect of fermentation conditions

由表2可以看出，對蟲草酸含量4 個因素的最佳組合為A2B2C2D3；而對蟲草米中SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)最佳組合為A2B2C2D1。由表3可知，各因素對蟲草酸含量影響大小依次為料水比、接種量、發(fā)酵溫度、避光發(fā)酵時間，接種量和料水比具有顯著性影響，另外兩種因素?zé)o顯著性。由表4可知，對蟲草米中SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的顯著順序依次為接種量、發(fā)酵溫度、料水比、避光發(fā)酵時間，接種量和料水比及發(fā)酵溫度具有顯著性差異，避光發(fā)酵時間無顯著性差異，與正交試驗結(jié)果一致。兩種指標(biāo)的前3 個因素條件和水平相同，最后一個因素為避光發(fā)酵時間，當(dāng)以蟲草酸含量為指標(biāo)時最佳避光發(fā)酵時間為10 d；而以SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)時最佳避光發(fā)酵時間為8 d。而因為避光發(fā)酵時間顯著性不高，且為了節(jié)約時間成本，以經(jīng)濟效益為主時選擇時間相對較短的因素8 d。故以SNSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)的最佳指標(biāo)為準(zhǔn)。綜合以上因素，最終蟲草米發(fā)酵優(yōu)化條件為：料水比1∶1.0、接種量20 mL/100 g、發(fā)酵溫度22 ℃、避光發(fā)酵時間8 d。

2.2 蟲草素含量

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y＝69.044x-29.439（R2＝0.999 9），其中y為峰面積，x為樣品中蟲草素含量。由公式求出蟲草米中蟲草素含量為（8.76±0.56）mg/g。

2.3 蟲草米體內(nèi)抗衰老實驗結(jié)果

2.3.1 蟲草米對果蠅壽命影響

由表5可知，與大米對照組相比，蟲草米低、中、高劑量組的雌、雄果蠅的半數(shù)死亡期、平均壽命和最高壽命均有延長，且隨著劑量的增加而增高，即存在量效關(guān)系。低、中、高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義。低劑量組的雌雄果蠅的平均壽命和最高壽命與大米對照組有顯著差異，而中、高劑量組的雌雄果蠅的半數(shù)死亡期、平均壽命、最高壽命與大米對照組有極顯著差異，說明蟲草米在一定程度上可以延長果蠅的壽命。通過雌雄的壽命對比還可以發(fā)現(xiàn)，雌果蠅的半數(shù)死亡期、平均壽命及最高壽命整體上比雄果蠅增長快，說明蟲草米對雌果蠅的壽命影響高于雄果蠅。

表5 不同蟲草米添加量對果蠅壽命的影響Table 5 Effects of C. militaris (L.) Fr.-fermented rice on the lifespan of D. melanogaster

2.3.2 蟲草米對雌果蠅體內(nèi)氧化水平影響

表6 不同蟲草米添加量對雌果蠅中抗氧化酶活性和MDA含量的影響Table 6 Effects of different dietary supplementation levels of C. militaris (L.) Fr.-fermented rice on antioxidant enzyme activities and MDA content in female D. melanogaster

由表6可知，與空白對照組及大米對照組相比，蟲草米低、中、高劑量組的雌果蠅體內(nèi)的SOD活性、CAT活力均明顯提高，差異極顯著（P＜0.01）。劑量組隨著劑量的增大兩種酶活力增強，呈現(xiàn)量效關(guān)系。蟲草米高劑量組的雌果蠅體內(nèi)SOD、CAT活性別高達61.98、17.52 U/mg。雌果蠅體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量隨蟲草米量的增加而降低，且呈量效關(guān)系。與大米對照組相比，低、中、高劑量組均表現(xiàn)出極顯著性差異。高劑量組果蠅體內(nèi)的MDA含量低至1.36 nmol/mg。

2.3.3 蟲草米對雄果蠅體內(nèi)氧化水平影響

表7 不同蟲草米添加量對雄果蠅中抗氧化酶活性和MDA含量的影響Table 7 Effects of different dietary supplementation levels of C. militaris (L.) Fr.-fermented rice on antioxidant enzyme activities and MDA content in male D. melanogaster

由表7可看出，雄性果蠅組織總SOD、CAT活性隨培養(yǎng)管中蟲草米添加量的增加而不斷增加。與空白對照組及大米對照組相比雄果蠅體內(nèi)的SOD、CAT活性明顯升高，MDA含量逐漸降低。中、高劑量組的雄果蠅機體的SOD、CAT活性及MDA含量與大米對照組相比，均呈顯著性極差異（P＜0.01）。高劑量組的雄性果蠅，體內(nèi)的SOD、CAT活性分別61.78、17.47 U/mg，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量降低至1.33 nmol/mg。

3 結(jié) 論

本研究主要目的是通過蟲草菌固態(tài)發(fā)酵普通大米，得到具有較高蟲草酸和SNSP含量的蟲草米。經(jīng)單因素試驗和正交試驗確定了固體發(fā)酵蟲草米的最佳條件為料水比1∶1.0、接種量20 mL/100 g、發(fā)酵溫度22 ℃、避光發(fā)酵時間8 d。體內(nèi)抗衰老實驗結(jié)果表明，不同添加量條件下飼養(yǎng)的果蠅的半數(shù)死亡期、平均壽命、最高壽命均高于空白對照組和大米對照組；實驗組的果蠅體內(nèi)的SOD活性、CAT活性均高于對照組，且隨著蟲草米添加量的增大，酶活性增強；實驗組果蠅體內(nèi)的MDA含量較空白對照組減少，且隨蟲草米添加量的增加而降低。研究結(jié)果表明蟲草米具有一定延緩衰老的作用。