高效液相色譜法分析蘆丁在灌胃給藥大鼠體內(nèi)的組織分布

李巧稚，肖丹丹，王曉穎，段青婭，劉雪松，李 倩

0 引言

蘆丁(Rutin，又名蕓香苷、路丁、絡(luò)通或槲皮素-3-O-蕓香糖苷)是黃酮醇槲皮素與蕓香二糖[α-L-鼠李吡喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖]形成的糖苷[1-2]，其廣泛分布于植物界，在植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子都有存在[3]。蘆丁的分子式為C27H30O26·3H2O(結(jié)構(gòu)式見圖1)，相對(duì)分子質(zhì)量為610.51。其熔點(diǎn)為177～178 ℃，在室溫下略溶于水，能溶于熱水和乙醇。蘆丁甲醇溶液的最大紫外吸收波長為258～361 nm，其遇光容易變質(zhì)，所以需要在陰涼處保存[2,4-5]。蘆丁具有多種藥理活性，主要包括抗自由基活性、抗脂質(zhì)過氧化氫作用、血管舒張作用、抗病毒作用、拮抗血小板活化因子作用、抗炎鎮(zhèn)痛作用、抗急性胰腺炎(AP)及對(duì)胃潰瘍的保護(hù)作用[6-11]。目前對(duì)于蘆丁的含量檢測(cè)主要采用高效液相色譜法[12-17]。曲克蘆丁為蘆丁的修飾藥物與臨床藥物，已用于多種疾病的臨床治療[18]。曲克蘆丁腦蛋白水解物注射液是曲克蘆丁與動(dòng)物腦蛋白水解液的復(fù)合制劑，具有通過血腦屏障的作用，可以更好地用于治療腦血管疾病[19-20]。蘆丁具有良好的發(fā)展前景，筆者對(duì)蘆丁在大鼠體內(nèi)的組織分布進(jìn)行了研究，為臨床疾病的治療提供依據(jù)。

圖1 蘆丁的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

1.1 材料 蘆丁對(duì)照品(國家標(biāo)準(zhǔn)含量：98%，西安天豐生物有限公司，CAS號(hào)：153-18-4)；山柰酚對(duì)照品(內(nèi)標(biāo)物，分析標(biāo)準(zhǔn)品，含量≥ 98%，阿拉丁，CAS號(hào)：520-18-3)；甲醇(色譜純，天津市光復(fù)精密化工研究所)；磷酸(分析純，含量：85%，天津市光復(fù)精密化工研究所)；乙酸(分析純，98%，天津市光復(fù)精密化工研究所)。

1.2 儀器 安捷倫高效液相色譜(Agilent 1260 series，Agilent 1260 DAD)；低溫離心機(jī)(Eppendroff公司)；離心機(jī)(Eppendoff公司)；精密天平(BS4202S型，瑞士Mettler公司)；數(shù)控水浴恒溫箱(寧波天恒儀器廠)；-80 ℃超低溫冰箱(Thermo公司)；低溫冷凍離心機(jī)(Beckman公司)；渦旋混合器(江蘇其林貝爾)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取8周齡健康雄性SD大鼠，體重(200±10) g，SD大鼠均來自于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，該中心已經(jīng)通過國際動(dòng)物委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇(A)-0.03%磷酸水(B)，梯度洗脫條件參見表1。柱溫：30 ℃；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長：258 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 對(duì)照品的制備

2.2.1 蘆丁儲(chǔ)備液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品37.50 mg于25 ml的容量瓶中，用組織提取液超聲溶解，配制成1.5 mg/ml的儲(chǔ)備液(在4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。

表1 梯度洗脫條件

2.2.2 內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液的制備 精密稱取山奈酚對(duì)照品10 mg于10 ml的容量瓶中，用組織提取液超聲溶解，配制成1 mg/ml的儲(chǔ)備液(在4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 取上述蘆丁儲(chǔ)備液，用組織提取液稀釋成蘆丁質(zhì)量濃度分別為0.75、1.5、3.0、15、75、425、750 μg/ml的系列對(duì)照品溶液。

2.2.4 質(zhì)控(QC)樣品的制備 新配制質(zhì)量濃度為定量下限、低、中、高4種濃度的蘆丁對(duì)照品溶液，其質(zhì)量濃度分別為0.75、1.5、15、750 μg/ml，在4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 組織提取液的制備 精密量取50 ml的乙酸置于500 ml的容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，作為組織提取液，在4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 各組織樣品的處理 移取大鼠肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、腦組織各1 g，分別加入定量的生理鹽水2 ml (1∶2,w/v)，用勻漿機(jī)勻漿成均勻的組織液。精密量取組織的勻漿液200 μl，置于1.5 ml離心管中，再加入組織提取液100 μl，渦旋振蕩1 min，然后以12 000 r/min離心10 min，取200 μl上清液，再加入10 μl的內(nèi)標(biāo)溶液。用孔徑為0.45 μm的有機(jī)濾頭過濾，取濾液10 μl進(jìn)樣，記錄各空白組織色譜圖。

2.4 專屬性考察 按照“2.3”項(xiàng)下進(jìn)行操作后，精密量取空白大鼠組織提取液100 μl，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，色譜圖見圖2A；在空白大鼠提取液加入一定濃度的蘆丁對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液，色譜圖見2B；大鼠灌胃給藥后，加入內(nèi)標(biāo)溶液，色譜圖見圖2C。

2.5 線性關(guān)系考察 移取空白對(duì)照組生物基質(zhì)(肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、腦組織)各0.15 g，加入定量的生理鹽水0.3 ml，用勻漿機(jī)勻漿成均勻的組織液。精密量取各組織的勻漿液200 μl，置于1.5 ml離心管中，再加入配制好的蘆丁對(duì)照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行處理，制備成終濃度為0.25、0.5、1、5、25、125、250 μl/ml的對(duì)照品溶液，取上述對(duì)照品溶液10 μl，注入色譜儀，記錄色譜圖。蘆丁在各組織中的線性范圍見表2，線性關(guān)系良好。

圖2 大鼠在組織樣品中蘆丁的HPLC色譜圖

取對(duì)照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，當(dāng)樣品的檢測(cè)信號(hào)與空白基質(zhì)的干擾信號(hào)比≥10，即信噪比(SIN)≥10時(shí)，即為測(cè)定濃度的最低定量限(LLOQ)。

2.6 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 精密量取空白對(duì)照大鼠的肺組織勻漿液200 μl，加入蘆丁QC樣品100 μl，按照“2.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行處理，得到質(zhì)量濃度為0.25、0.5、5、250 μg/ml 4種濃度的QC樣品溶液，每個(gè)濃度點(diǎn)制備5份平行樣，連續(xù)測(cè)定3 d，按照上述的色譜條件進(jìn)行分析，以蘆丁與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，計(jì)算回收率和精密度。見表3。

表2 蘆丁的線性關(guān)系與線性范圍(μg/ml)

表3 蘆丁的準(zhǔn)確度與精密度測(cè)定結(jié)果(n=5，n=15)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下制備低、中、高3種濃度的QC樣品，按照“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行處理，每個(gè)濃度點(diǎn)制備5份平行樣，1周內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)定大鼠肺臟組織勻漿樣品中蘆丁的含量，結(jié)果顯示，其含量均無明顯變化，RSD<15%。見表4。

表4 室溫條件下1周內(nèi)蘆丁穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果(n=5)

2.8 提取回收率試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下制備低、中、高3種濃度的蘆丁對(duì)照品，按照“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行處理，每個(gè)濃度點(diǎn)制備5份平行樣，按照上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算蘆丁與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積的平均比值A(chǔ)；另外，配制相同的低、中、高濃度的QC樣品各1份，按照上述HPLC條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各個(gè)濃度對(duì)照品溶液中蘆丁的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的平均比值B；按A/B×100%計(jì)算各個(gè)濃度點(diǎn)的提取回收率，見表5。

表5 蘆丁提取回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

2.9 組織分布研究 取雄性SD大鼠12只，隨機(jī)分成2組，第1組將蘆丁超聲溶于5% CMC-NA制成混懸液，按照生藥量200 mg/(kg·d)灌胃給藥。第2組給予相同體積的生理鹽水，每隔10 h灌胃給藥1次，給藥5次后將SD大鼠全部處死。分離大鼠肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、腦組織，用生理鹽水將血液洗凈，濾紙擦干。按照“2.3”項(xiàng)處理組織樣品，測(cè)定并計(jì)算給藥后大鼠肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、腦組織的蘆丁含量，結(jié)果以每1 ml組織中待測(cè)成分的量(μg)表示，見圖3。

圖3 灌胃給藥蘆丁在各組織中的濃度(n=6)

3 討論

3.1 給藥方案的選擇 蘆丁的藥物動(dòng)力學(xué)表明其符合二房室模型，蘆丁在體內(nèi)吸收較快。根據(jù)對(duì)蘆丁藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的分析[21]，本實(shí)驗(yàn)室采用每間隔10 h給藥1次，共給藥5次，使蘆丁達(dá)到穩(wěn)定血藥濃度后進(jìn)行測(cè)定。

3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)通過高效液相色譜法測(cè)定大鼠在各組織中蘆丁的含量，該方法操作簡單，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，相比于液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)，該方法使用的儀器價(jià)格低廉，應(yīng)用廣泛。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)用甲醇與酸水作為流動(dòng)相，不僅對(duì)環(huán)境破壞小，而且價(jià)格較低，方便易得。

3.3 結(jié)果分析 蘆丁在大鼠體內(nèi)分布廣泛，且在肌肉和腎臟分布較多，其次是肝臟和肺臟，在腦中未檢出，這可能是由于血腦屏障的原因。在臨床治療過程中，為了達(dá)到曲克蘆丁腦部治療的作用，可將其制成曲克蘆丁腦蛋白水解液，這與本文的檢測(cè)結(jié)果一致。