右歸丸能啟動小鼠胚胎干細胞1B10和D3的生殖分化

向俊蓓 劉綿學(xué) 謝林峰 萬 謙

(四川護理職業(yè)學(xué)院，四川 成都 610000)

補腎中藥復(fù)方右歸丸是由金匱腎氣丸減去“三瀉”(澤瀉、 茯苓、丹皮)，加鹿角膠、菟絲子、杜仲、枸杞子、當(dāng)歸而成，具有溫補腎陽作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)右歸丸能增強機體免疫功能、保護實驗性腎陽虛動物的重要臟器、調(diào)節(jié)性激素含量、抗衰老、調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸含量、調(diào)節(jié)血漿腎素活性和醛固酮含量〔1〕。補腎中藥單體齊墩果酸能夠在體外誘導(dǎo)多種胚胎干細胞向生殖細胞方向的分化〔2，3〕，右歸丸中的山茱萸含有一定量的齊墩果酸，且右歸丸同為補腎中藥，提示其可能也有此誘導(dǎo)作用。本文擬分析右歸丸對干細胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及細胞株 20只清潔級SD大鼠，體重180～220 g，雌雄各10只，合格證號：SCXK(川)2008-19，使用許可證號：SYXK(川)2008-100。小鼠胚胎干細胞1B10來源于四川大學(xué)華西校區(qū)，小鼠胚胎干細胞D3購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2藥品和試劑 右歸丸(批號1013451)購自北京同仁堂，藥準(zhǔn)字號為Z23020593(北京)，DMEM高糖培養(yǎng)液(批號20130401)、胎牛血清(FBS)(批號20130405)、細胞培養(yǎng)用雙抗(青霉素和鏈霉素)(批號20130315)、磷酸緩沖液(PBS)(批號20130505)、細胞消化用胰蛋白酶(批號20130408)均購自成都哈里公司；非必需氨基酸(NEAA)(批號：03985 K11)、β-巰基乙醇(β-ME)(批號：862986)由美國Gibco公司生產(chǎn)；白血病抑制因子(LIF)(批號：1993949)由美國Millipore公司生產(chǎn)；普通細胞6孔培養(yǎng)板(批號：04718601)和超低吸附培養(yǎng)6孔板(批號：10312041)由美國Corning公司生產(chǎn)；RNA提取試劑盒Tri Reagent(批號：4071)由美國Molecular Research Center公司生產(chǎn)；cDNA合成試劑盒(批號：00128824)由Fermentas公司生產(chǎn)；Sybr Green Qpcr試劑盒(批號：14128600)由Roche公司生產(chǎn)。

1.3儀器 中國優(yōu)普公司制造的純水機(UPR-I-10T)；美國Thermo Scientific公司制造的CO2細胞培養(yǎng)箱(3111)；中國蘇州凈化公司制造的超凈工作臺(SW-CJ-2FD)；中國Anke公司制造的50 ml離心機(TDL-40B)；美國Thermo公司制造的高速臺式冷凍離心機(Legend Micro 17R)；Leica公司制造的倒置顯微鏡(DMI3000B)；Bio-Rad公司制造的定量PCR儀(CFX96)。

1.4培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞 使用小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3培養(yǎng)1B10和D3的飼養(yǎng)層細胞。用DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)NIH3T3，DMEM高糖培養(yǎng)液成分：10% FBS、100 U/ml盤尼西林、0.1 mg/ml 鏈霉素。培養(yǎng)干細胞的DMEM高糖培養(yǎng)液成分：17% FBS、100 U/ml 盤尼西林、0.1 mg/ml 鏈霉素、0.1 mmol/L NEAA、0.1 mmol/L β-ME、1 000 U/ml LIF。培養(yǎng)孔中的NIH3T3生長到90%匯合度時，加入絲裂霉素C，至終濃度為10 μg/ml。放入細胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，之后用無菌PBS清洗細胞5次，加入適量的干細胞培養(yǎng)液，接種干細胞至培養(yǎng)孔，每天更換培養(yǎng)液，4～7 d后培養(yǎng)完成。

1.5誘導(dǎo)擬胚體(EB)的形成 誘導(dǎo)EB形成的培養(yǎng)液：DMEM高糖培養(yǎng)液，17% FBS、100 U/ml 盤尼西林、0.1 mg/ml 鏈霉素、0.1 mmol/L NEAA、0.1 mmol/L β-ME。加入胰蛋白酶消化細胞；將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中孵育3 min；吹打細胞呈單細胞狀態(tài)；溫浴細胞混合液，利用差速貼壁法分離飼養(yǎng)層細胞NIH3T3和干細胞；收集混合液靜置后的上清液(大部分懸浮細胞為干細胞)，移入超低吸附培養(yǎng)板；24 h后，可觀察到懸浮的類圓形誘導(dǎo)EB形成，收集所有EB待用。

1.6制備右歸丸大鼠含藥血清(YGW-RS)及空白血清(RBS) 取20只SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為空白組和含藥組每組10只。含藥組灌服液化后的右歸丸，劑量均為5.0 g/kg，給藥容量均為20 ml/kg，空白組灌服蒸餾水。給藥后30、60、90 min 分別眼底靜脈叢取血，靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離每組不同時間段的血清，混勻每組3個時間段的血清，過濾除菌備用。

1.7用右歸丸大鼠含藥血清干預(yù)干細胞形成的誘導(dǎo)EB 將收集到的EB移入普通細胞培養(yǎng)板。24 h內(nèi)EB貼壁并生長；24 h后，對相應(yīng)的培養(yǎng)孔中分別加入YGW-RS和RBS，血清終濃度為4.5%(V/V)，不加入任何血清的培養(yǎng)孔做空白對照(BCC)。干預(yù)72 h后，對比細胞形態(tài)的變化。

1.8實時熒光定量PCR(qPCR)分析 貼壁的EB被干預(yù)72 h后，提取各孔的總RNA，合成cDNA，以cDNA為模板進行qPCR分析，目標(biāo)基因為11種與生殖分化相關(guān)的基因，Oct-4正向：CGGAAGAGAAAG CGAACTAGCA，反向：TGATTGGCGATGTGAGTGA TC；GDF-9正向：TGCTTTGCCTGGCTGTGTT，反向：TCTACAGGCAGCAGCAAGGA；Stra8正向：TGCCACCTGCAA CTCAGAAA，反向：CTGGTTCCTGGTTTAATGGAGTGT；SCP3正向：ATCTGGGAAGCCACCTTTGG，反向：CTGGAGCCTTTTCATCAGCAA；Mvh正向：CAAAGGAACA ACGCCAAACC，反向：TTGCCCAACAGCGACAAAC；ZP1正向：TCGAGCCTGGCTTTGAATACA，反向：CAA ACCGGTTCCCAAATTCAT；ZP2正向：CTCTCTTCACTCAAGCTGACCTTCT，反向：AAACCCATCCTGTGCACACA；ZP3正向：CCGGGTGTCCGTGGATAC，反向：CGA GGGTCGTGGAGTAGGAA；Itga6正向：GACATGAAGT CCGCGCATCT，反向：TGCCACCCATCTGCATT；Itgb1正向：TCCAAATAAGGAGTCTGAAACCATT，反向：GGA TGCCATGGCTTTGACA；TP2正向：CATCCGTGCACTCT CGACACT，反向：CCTCCTGACGGCCTTTCTCT；以GA PDH作為內(nèi)參基因，GAPDH正向：GGCAAATTCA ACGGCACAGT，反向：GCCTCACCCCATTTGATGTT。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1干細胞的生長和EB形成 1B10和D3分別在飼養(yǎng)層細胞NIH3T3上形成了類似“鳥巢”狀的克隆，說明兩種干細胞生長正常；兩種干細胞都形成了類圓形的EB，說明EB形成正常，見圖1。

2.2右歸丸對貼壁生長EB的干預(yù) 干預(yù)后，1B10的EB貼壁生長后除了被RBS細胞干預(yù)的更細碎外，其余被干預(yù)的細胞形態(tài)相近。D3的EB貼壁生長后被各藥物干預(yù)后的細胞形態(tài)相近，見圖2。

圖2 干預(yù)后1B10、D3的EB貼壁生長后細胞形態(tài)(標(biāo)尺=100 μm)

2.3YGW-RS對1B10和D3生殖分化的影響 對于1B10，RA顯著上調(diào)Stra8、Mvh、ZP1、ZP2表達，顯著下調(diào)SCP3、ZP3、Oct-4表達(P<0.05)；對于D3，RA顯著上調(diào)Stra8表達，顯著下調(diào)Oct-4、GDF-9、SCP3、Mvh、ZP3、Itga6表達(P<0.05)；對于1B10，YGW-RS顯著上調(diào)Oct-4、SCP3、Mvh、ZP1、ZP2、ZP3、Itga6表達，顯著下調(diào)Stra8表達(P<0.05)；對于D3，YGW-RS顯著上調(diào)Oct-4、GDF-9、Stra8、ZP2、TP2表達(P<0.05)，見表1，表2。

表1 RA對1B10、D3生殖分化標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄表達的影響

表2 YGW-RS對1B10、D3生殖分化標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄表達的影響

3 討 論

胚胎干細胞已有被成功誘導(dǎo)分化為生殖細胞的報道，甚至利用分化出的生殖細胞完成了受精、形成胚胎等過程〔4，5〕，而且，胚胎干細胞的多能性高于成體干細胞，理論上對右歸丸可能的促分化作用更敏感。

Oct-4對于保持干細胞的多能性很重要，過低或者過高的Oct-4將導(dǎo)致干細胞分化〔6，7〕。GDF-9 是向雌性生殖細胞分化的早期標(biāo)記基因〔8〕。Stra8是向雄性和雌性生殖細胞分化的共同的早期標(biāo)記基因〔9〕。SCP3 是減數(shù)分裂的早期標(biāo)記基因〔10〕。Mvh是向雌性生殖細胞和雄性生殖細胞分化的早期標(biāo)記基因〔11〕。ZP1、ZP2和ZP3是卵子細胞形成的標(biāo)記基因〔12〕。Itga6、Itgb1和TP2 是精子細胞形成的標(biāo)記基因〔4，5〕。

本研究說明右歸丸啟動了1B10的雌性生殖分化，同時啟動了D3的雄性和雌性生殖分化；RA啟動了1B10的雄性生殖分化，RA不能啟動D3的生殖分化。補腎中藥復(fù)方右歸丸能啟動所考察的兩種干細胞的生殖分化，而且表現(xiàn)出的誘導(dǎo)作用的普遍性高于公認的生殖分化誘導(dǎo)物RA，右歸丸可能具有啟動干細胞生殖分化的能力。