甘氨酸通過抑制大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后炎癥反應(yīng)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

唐俊春 潘夢鮮 劉瑞 萬芪

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是導(dǎo)致人類死亡及殘疾的重要原因[1]。炎癥反應(yīng)是TBI后繼發(fā)的神經(jīng)功能損傷的重要原因。TBI后可發(fā)生炎癥反應(yīng)，釋放大量的炎癥因子[1]。很多證據(jù)表明TBI后神經(jīng)細(xì)胞死亡和神經(jīng)功能缺損與炎癥反應(yīng)有關(guān)[2]。甘氨酸(Glycine)是最簡單的氨基酸，為人體非必需氨基酸。近年研究表明甘氨酸具有神經(jīng)保護(hù)作用，能明顯改善缺血再灌注損傷、腦出血等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3]。但甘氨酸對TBI是否也具有神經(jīng)保護(hù)作用，是否調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程目前尚不清楚。本研究建立大鼠腦損傷模型，探討甘氨酸對TBI后腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)的影響，為甘氨酸對TBI的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型

50只SPF級SD雄性大鼠購自武漢大學(xué)動物實驗研究中心，體重250～280 g；按數(shù)字表法隨機(jī)分為對照(Sham)組、腦損傷+溶劑(TBI+Vehicle)組和腦損傷+甘氨酸(TBI+Glycine)組，TBI模型參照Feeney’s自由落體打擊法[4]；10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后局部皮膚消毒、切開，暴露顱骨，找到前囟點；將大鼠固定于立體定位儀，以前囟后1.5 mm，中線右側(cè)2.5 mm處為中心，用牙科鉆鉆一直徑5 mm骨窗，暴露硬腦膜，注意保持硬腦膜完整；安裝固定顱腦損傷打擊器，將20 g打擊錘從硬腦膜上方20 cm處自由落下，打擊后骨蠟封閉傷口，縫合皮膚；對照組僅去骨瓣后骨蠟封閉。

術(shù)后1 h側(cè)腦室注射甘氨酸(購自美國Sigma公司)，注射劑量為2 mg/kg；甘氨酸溶于生理鹽水中；腦損傷+溶劑組注射等體積的生理鹽水；術(shù)后24 h取腦，用于腦含水量的測定、蛋白免疫印跡檢測，冰凍切片進(jìn)行Fluoro-Jade C染色和炎癥因子水平檢測。

1.2 腦含水量的測定

TBI后24 h用10%水合氯醛腹腔麻醉后斷頭取腦，取創(chuàng)傷灶附近的腦皮層1塊，約(200±20)mg，電子分析天平上稱濕重后將腦組織置于100 ℃烘箱烘烤24 h，再測干重，腦組織含水量(%)=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.3 蛋白免疫印跡

10%水合氯醛腹腔注射麻醉，生理鹽水灌注后分離損傷側(cè)附近皮層組織，加入含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的裂解液勻漿，12000 r/min 4 ℃ 離心15 min，取上清液；BCA法檢測蛋白水平；10% SDS-PAGE分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗3次后加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后加入ECL顯色液，熒光成像儀成像；蛋白檢測所用一抗：anti-Neun(Monoclonal，1∶500)，anti-GAPDH(Cell signaling technology，1∶2000)。

1.4 Fluoro-Jade C(FJC)染色

大鼠麻醉后分別用生理鹽水、4%多聚甲醛灌注；取腦后冰凍切片，厚度為15 μm；用PBS洗去多聚甲醛5次，乙醇浸洗，0.06%高錳酸鉀搖床震搖10 min，蒸餾水洗滌2次；FJC染液避光染色20 min，蒸餾水洗滌3次，50 ℃烘烤玻片10 min；二甲苯透明2 min后中性樹脂封片；熒光顯微鏡下觀察，并在400倍視野下隨機(jī)選取5個視野計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5 ELISA實驗

取創(chuàng)傷灶附近的腦皮層少量，制備腦組織勻漿10 min，4000 r/min，離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒(大連美侖生物技術(shù)有限公司)檢測損傷側(cè)大腦皮層中炎癥因子白介素1β(IL-1β)，白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)水平。按試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Glycine可減輕TBI后腦水腫

TBI后可引起腦組織發(fā)生水腫，表現(xiàn)腦含水量增加。如圖1所示，TBI+Vehicle組含水量明顯高于Sham組(P<0.05)，而TBI+Glycine組含水量低于TBI+Vehicle組(P<0.05)。

圖1 TBI后各組腦含水量的測定 與Sham組比較,*P<0.05;與TBI+Vehicle組比較,#P<0.05,n=5

2.2 Glycine減輕皮層神經(jīng)元損傷

TBI后可誘發(fā)或加重神經(jīng)元損傷。Neun是神經(jīng)元特異性表達(dá)蛋白，其含量可間接反映神經(jīng)元數(shù)量的變化。免疫印跡顯示，TBI+Vehicle組Neun的表達(dá)水平顯著低于Sham組(P<0.05)，而TBI+Glycine組Neun表達(dá)水平顯著高于TBI+Vehicle組(P<0.05)(圖2)。

2.3 Glycine降低神經(jīng)元的退化

為進(jìn)一步研究Glycine對TBI后具有神經(jīng)保護(hù)作用，在TBI后24 h用FJC染色，F(xiàn)JC標(biāo)記大量退化的神經(jīng)元(綠色)出現(xiàn)在損傷病灶區(qū)的周圍組織中；TBI+Vehicle組退化神經(jīng)元的數(shù)量高于Sham組，TBI+Glycine組退化神經(jīng)元的數(shù)量較TBI+Vehicle組下降(圖3)。

圖2 TBI大鼠損傷側(cè)皮層神經(jīng)元標(biāo)志物Neun的表達(dá) 與Sham組比較,*P<0.05;與TBI+Vehicle組比較,#P<0.05,n=5

圖3 TBI后病灶區(qū)周圍皮層FJC陽性神經(jīng)元數(shù)目的檢測 A為各組陽性細(xì)胞數(shù);B為陽性細(xì)胞所占的相對量;與Sham組比較,*P<0.05;與TBI+Vehicle組比較,#P<0.05,n=5,比例尺=50 μm

2.4 Glycine抑制TBI后炎癥因子的表達(dá)

采用ELISA法檢測TBI 24 h后損傷周圍區(qū)皮層組織勻漿中炎癥因子的表達(dá)水平，TBI+Vehicle組炎癥因子的表達(dá)水平顯著高于Sham組，TBI+Glycine組炎癥因子的表達(dá)水平低于TBI+Vehicle組(圖4)。

圖4 TBI大鼠損傷側(cè)炎癥因子的表達(dá)水平 A為各組IL-1β水平的比較;B為各組IL-6水平的比較;C為各組TNF-α水平的比較;與Sham組比較,*P<0.05;與TBI+Vehicle組比較,#P<0.05,n=5

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)TBI大鼠腦損傷后可引起損傷周圍區(qū)發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎癥因子的表達(dá)水平升高[5]。甘氨酸又稱氨基乙酸，是一種化學(xué)結(jié)構(gòu)最簡單的氨基酸，也是人體內(nèi)的一種非必需氨基酸[6]，能被生物體自主合成，為合成其他氨基酸提供氮源。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中甘氨酸是一個抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明甘氨酸在體外和體內(nèi)的實驗條件下均具有細(xì)胞保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)的作用[7-8]。重要的是，臨床試驗顯示甘氨酸治療可改善缺血性腦卒中患者的預(yù)后[9]。然而，目前還沒有關(guān)于甘氨酸與TBI關(guān)系的報道。本研究采用Feeney法建立大鼠TBI模型，依據(jù)研究報道選取2 mg/kg劑量的甘氨酸在大鼠TBI后1 h給予側(cè)腦室注射治療[10]，選擇TBI后24 h取材進(jìn)行指標(biāo)測定，結(jié)果顯示甘氨酸可減輕大鼠TBI后腦水腫，降低神經(jīng)元的損傷程度。這些結(jié)果提示了甘氨酸對大鼠TBI后有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，但其保護(hù)機(jī)制特別是TBI后炎癥反應(yīng)是否參與此過程不明確。

炎癥反應(yīng)對TBI后神經(jīng)功能的損傷起著重要的作用。有研究表明TBI后腦組織局部發(fā)生炎癥反應(yīng)，釋放大量的炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α，破壞了血腦屏障，增加其通透性，進(jìn)而加劇了腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞損傷[11-12]。本研究結(jié)果證實大鼠TBI后24 h病灶區(qū)周圍皮層的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平明顯增高，與腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞損傷有一定的關(guān)系。這提示了炎癥反應(yīng)在TBI后腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)起著重要作用。與腦損傷+溶劑組相比，腦損傷+甘氨酸組能明顯降低炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，降低TBI后炎癥反應(yīng)，這表明了甘氨酸可通過抑制TBI后炎癥反應(yīng)來起到神經(jīng)保護(hù)作用。但是甘氨酸是如何調(diào)控TBI后炎癥因子表達(dá)水平的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，甘氨酸對大鼠TBI后具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平來減輕TBI后繼發(fā)的炎癥反應(yīng)。