米諾環(huán)素對(duì)慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)Notch信號(hào)通路的影響

陳毅 尤志珺 王傳玲 隨曉菲 蔡志友

米諾環(huán)素作為四環(huán)素類藥物中一種的有效的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑，具有抗炎、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)、氧化氮類產(chǎn)物的產(chǎn)生和細(xì)胞調(diào)亡過程等作用[1-6]。有研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素是一種有效的腦保護(hù)劑，并能降低血管性認(rèn)知功能損害的癥狀[2-3]。有研究證實(shí)米諾環(huán)素可以有效促進(jìn)VEGF的生物活性[7]，而VEGF是腦缺血后血管新生的重要因子之一[8-10]。Notch信號(hào)通路是血管新生、內(nèi)皮細(xì)胞形成的關(guān)鍵信號(hào)通路，激活Notch信號(hào)通路可增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、侵襲和血管形成的能力，而抑制Notch信號(hào)通路，則內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、侵襲和血管形成的能力受到抑制。本實(shí)驗(yàn)通過抑制Notch信號(hào)通路及米諾環(huán)素給藥后觀察大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力以及觀察血管內(nèi)皮生長因子VEGF和Notch信號(hào)通路下游蛋白Hes1的表達(dá)水平，以進(jìn)一步探討米諾環(huán)素是否可以通過調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路進(jìn)而影響腦組織血管修復(fù)能力，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠40只(雄性，260～300 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號(hào) SYXK(鄂)2011-0031)，按照隨機(jī)原則分為5組(n=8):假手術(shù)(Sham)組、缺血模型(Model)組、 DAPT(DAPT)組、米諾環(huán)素(Min)組、DAPT+米諾環(huán)素(DAPT+Min)組。

1.1.2 試劑及設(shè)備 鹽酸米諾環(huán)素膠囊(100 mg/粒)，惠氏制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：M33265；DAPT抑制劑 (ab120633)，Abcam公司；Anti-Hes1 antibody (ab108937)，Abcam公司；Anti-VEGF antibody (ab1316)，Abcam公司；MT-200 Morris水迷宮綜合跟蹤系統(tǒng)(由湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供)。

1.2 方法

1.2.1 2-VO模型制備 參照文獻(xiàn)[11-12]制作大鼠慢性腦缺血模型：手術(shù)前12 h禁食水，用3.5%的水合氯醛，按1 mL/100 g體重對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉后仰臥固定，備皮，消毒，沿頸正中線切開皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，行雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎術(shù)，術(shù)后注意保溫，常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，余處理同缺血模型組大鼠。

1.2.2 給藥 將米諾環(huán)素用生理鹽水稀釋成5 mg/mL濃度備用，DAPT溶于DMSO中并在5%葡萄糖溶液中稀釋備用。假手術(shù)組、缺血模型組給予等量的生理鹽水灌胃；DAPT組予以Notch抑制劑DAPT(按10 μmol/kg腹腔注射，建模成功后給藥1次，以后每周給藥1次，其他處理同缺血模型組)；米諾環(huán)素組以50 mg/kg米諾環(huán)素灌胃；DAPT+米諾環(huán)素組給藥：在DAPT組的基礎(chǔ)上同時(shí)給予50 mg/kg米諾環(huán)素灌胃。于建模成功正常飼養(yǎng)2 d后開始給藥，連續(xù)給藥4周。米諾環(huán)素的劑量選擇參考Stirling等[13]和Yrjanheikki等[14]的有關(guān)米諾環(huán)素神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的研究，DAPT使用方法參考Huang Man等[15]的有關(guān)DAPT作用神經(jīng)細(xì)胞的研究。

1.2.3 行為學(xué)檢測(cè) 在給藥飼養(yǎng)4周后測(cè)試大鼠在Morris水迷宮(Morris water maze, MWM)實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的長短和跨越原平臺(tái)區(qū)位置的次數(shù)。(1) 定位航行實(shí)驗(yàn)：水迷宮水深35 cm，水溫25 ℃，在固定象限設(shè)有安全島，高度33 cm，液面高于安全島2 cm;共歷時(shí)5 d，每組大鼠每天時(shí)間固定;大鼠入水點(diǎn)順序?yàn)榈? d，E-S-W-N；第2 d，S-W-N-E；第3 d，W-N-E-S;第4 d，N-E-W-S；第5 d，E-W-N-S;記錄每次找到平臺(tái)的時(shí)間(即逃避潛伏期，以秒為單位計(jì)時(shí));如大鼠在60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)，潛伏期記為60 s，每次間隔5 min讓大鼠休息，再行下次實(shí)驗(yàn);(2) 空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)第5 d的最后1次結(jié)束時(shí)撤除平臺(tái)，將大鼠從任選的非平臺(tái)象限入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄大鼠第1次到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間以及2min內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)和大鼠在池中的游泳路徑，計(jì)算大鼠在平臺(tái)象限游泳路徑長度占總路徑長度的百分比。

1.2.4 免疫組化實(shí)驗(yàn) 用3.5%水合氯醛麻醉大鼠，打開胸腔，經(jīng)左心室快速灌注生理鹽水，直至右心房流出液清亮為止；然后用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦；冠狀切取視交叉后部腦組織，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋；常規(guī)切片3～4 mm，70°烤片2 h；二甲苯脫蠟，梯度酒精洗滌， 3% H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性酶；滴加羊血清封閉液10 min；不同切片分別加入適量的羊抗大鼠Hes1、小鼠抗大鼠VEGF，37 ℃ 60 min或4 ℃冰箱過夜；加反應(yīng)增強(qiáng)劑，37 ℃恒溫孵育20 min；分別滴加辣根酶標(biāo)兔抗羊IgG及兔抗小鼠IgG，37 ℃恒溫孵育30 min；除加入羊血清封閉液外，以上各步間均用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)充分洗滌；最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，中性樹膠封片。用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定陽性細(xì)胞表達(dá)的面積，然后將假手術(shù)組定為1，換算其余各組相對(duì)值。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法 各組腦組織加入細(xì)胞裂解液充分裂解，離心，BCA 方法行蛋白定量；取50 μg蛋白變性，經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別和羊抗大鼠Hes1多克隆抗體、小鼠抗大鼠VEGF單克隆抗體作用，4 ℃過夜；洗滌后分別加入辣根過氧化物酶結(jié)合的兔抗羊IgG(1∶5000)及兔抗小鼠IgG (1∶2000)，室溫孵育1 h；于超高靈敏度化學(xué)成像發(fā)光儀照相，Image Lab 3.0軟件測(cè)定灰度值，與相應(yīng)β-actin比較后將假手術(shù)組定為1，計(jì)算其余組相對(duì)值。所有蛋白質(zhì)免疫印跡都在同組不同樣品上得到重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 死亡率 假手術(shù)組大鼠無死亡，缺血模型組死亡1只，DAPT組死亡2只，米諾環(huán)素組無死亡，DAPT+米諾環(huán)素組死亡1只。以上大鼠均死于術(shù)后48 h內(nèi)，不列入統(tǒng)計(jì)，另隨機(jī)選取大鼠補(bǔ)齊。各組大鼠死亡率比較無明顯差異(P>0.05)。

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 與假手術(shù)組比較，缺血模型組的水迷宮定位航行逃避潛伏期延長(P<0.05)，第1次跨越平臺(tái)時(shí)間延長(P<0.05)，跨越平臺(tái)平均次數(shù)減少(P<0.05)；DAPT組與缺血模型組比較、米諾環(huán)素組與DAPT組比較、DAPT+米諾環(huán)素組分別于DAPT組和米諾環(huán)素比較，逃避潛伏期、第1次跨越平臺(tái)時(shí)間及跨越平臺(tái)平均次數(shù)有顯著差異(P<0.05)(表1～2、圖1)。

表1 水迷宮空間探索第1次跨越平臺(tái)時(shí)間及跨越平臺(tái)次數(shù),n=8)

注：與Sham組比較，*P<0.05；與Model組比較，?P<0.05；與DAPT組比較，#P<0.05；與DAPT組和Min組比較，△P<0.05

圖1 各組大鼠行為學(xué)檢測(cè)組 A、B為各組大鼠逃避潛伏期;C為各組大鼠跨越平臺(tái)時(shí)間;D為各組跨越平臺(tái)次數(shù);與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與缺血模型組比較, ▲P<0.05;與DAPT組比較, #P<0.05;與DAPT抑制劑組和米諾環(huán)素組比較, ◆P<0.05

2.3 免疫組織化學(xué)染色法 與假手術(shù)組比較，缺血模型組Hes1和VEGF表達(dá)水平增高(P<0.05)；與缺血模型組比較，DAPT組Hes1和VEGF表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與缺血模型組比較，米諾環(huán)素組Hes1和VEGF表達(dá)水平增高(P<0.05)；與DAPT組比較，米諾環(huán)素組Hes1和VEGF表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)；與DAPT組比較，DAPT+米諾環(huán)素組Hes1和VEGF表達(dá)水平增高(P<0.05)(圖2)。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法 與缺血模型組比較，DAPT組Hes1和VEGF灰度值下降(P<0.05)；與缺血模型組比較，米諾環(huán)素組Hes1和VEGF灰度值增高(P<0.05)；與DAPT組比較，米諾環(huán)素組Hes1和VEGF灰度值增高(P<0.01)；與DAPT組比較，DAPT+米諾環(huán)素組Hes1和VEGF灰度值增高(P<0.05)(圖3)。

表2 水迷宮定位航行逃避潛伏期,s,n=8)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血模型組比較，▲P<0.05；與DAPT組比較，#P<0.05；與DAPT組和米諾環(huán)素組比較，◆P<0.05

圖2 各組大鼠Hes1及VEGF免疫組化染色(海馬CA1區(qū) SP ×400倍) A為各組大鼠Hes1的表達(dá)水平;B為各組大鼠VEGF表達(dá)水平;與假手術(shù)組比較,▲P<0.05;與缺血模型組比較,?P<0.05,#P<0.05;與DAPT組比較,△P<0.01,*P<0.05

圖3 各組大鼠Hes1及VEGF Western blot印跡檢測(cè) A為各組大鼠Hes1表達(dá)水平;B為各組大鼠VEGF表達(dá)水平;與缺血模型組比較, ?P<0.05,#P<0.05;與DAPT組比較,△P<0.01,*P<0.05

3 討 論

腦缺血后血管增生修復(fù)能力受損。有研究證明腦缺血后微血管的密度與腦梗死的面積相關(guān)[16]，微血管的新生為神經(jīng)的再生創(chuàng)造了條件,這對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)產(chǎn)生了重要作用。由此可見，腦缺血后大腦微血管網(wǎng)的重建對(duì)受損部位的恢復(fù)是很重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

血管新生是指在原有血管的基礎(chǔ)上內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和重塑，進(jìn)而形成新血管的過程，涉及諸多的生長因子和信號(hào)通路分子[17]，Notch信號(hào)通路就是其中比較重要的一個(gè)。眾所周知，血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是血管生長因子中最重要的一員，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生[18]。VEGF能直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)、增殖及分裂，并增加微血管通透性。VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞上的兩種受體KDR和Flt-1高親和力結(jié)合后直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其遷移和形成管腔樣結(jié)構(gòu)；同時(shí)還可增加微血管通透性，引起血漿蛋白(主要是纖維蛋白原)外滲，并通過誘導(dǎo)間質(zhì)產(chǎn)生而促進(jìn)體內(nèi)新生血管生成[18]。Notch信號(hào)通路是一個(gè)在進(jìn)化中高度保守的細(xì)胞間信號(hào)傳遞通路，由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)和轉(zhuǎn)錄因子CSL(一類DNA結(jié)合蛋白)等組成,Notch蛋白是一種細(xì)胞表面跨膜受體，Notch有4個(gè)Notch同源基(Notch1-4) 和5個(gè)配體(Jagged1，2；Delta1，2，3)，Notch蛋白是一種細(xì)胞表面跨膜受體，其胞外段包含表皮生長因子樣重復(fù)受體，可與配體的Delta等相互作用。配體一旦與受體結(jié)合在早老蛋白-1(Presenilin-1)/γ-分泌酶作用下Notch發(fā)生兩次溶蛋白性裂解后Notch蛋白的胞內(nèi)區(qū)域 (Notchintracellulardomain,NICD)，NICD作為Notch的活化形式轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核,與DNA結(jié)合蛋白CSL(CBF-1/RBPJk-Su(H)-LAG1 )結(jié)合并使之活化，激活Hes家族，進(jìn)而發(fā)揮一系列的生物學(xué)效應(yīng)[19-20]。有研究證實(shí)Notch信號(hào)通路激活可增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、侵襲和血管形成的能力，促進(jìn)腦外傷后神經(jīng)血管的修復(fù),而抑制Notch信號(hào)通路，內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、侵襲和血管形成的能力受到抑制[8-10]。本實(shí)驗(yàn)通過DAPT抑制劑抑制Notch信號(hào)通路，VEGF的表達(dá)水平明顯降低也說明了這一點(diǎn)。腦缺血后Notch信號(hào)通路被激活，本實(shí)驗(yàn)中缺血模型組的Hes1表達(dá)水平較假手術(shù)組增高證實(shí)了這一點(diǎn)，同時(shí)缺血模型組的VEGF表達(dá)水平較假手術(shù)組也增高，也證實(shí)了Notch信號(hào)通路的激活可提高損傷腦組織的血管修復(fù)能力。

米諾環(huán)素作為一種有效的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑，具有抗炎、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)、氧化氮類產(chǎn)物的產(chǎn)生和細(xì)胞調(diào)亡過程等作用[1-6]。有研究證實(shí)米諾環(huán)素也可以有效促進(jìn)VEGF的生物活性[7]。本實(shí)驗(yàn)中米諾環(huán)素組的VEGF的表達(dá)水平明顯較缺血模型組增高，也進(jìn)一步證實(shí)了米諾環(huán)素可以增強(qiáng)VEGF的活性。

本實(shí)驗(yàn)中米諾環(huán)素組中的Hes1的表達(dá)水平較DAPT組和缺血模型組增高，DAPT+米諾環(huán)素組的Hes1的表達(dá)水平較DAPT組增高，表明米諾環(huán)素可以作用于Notch信號(hào)通路中。同時(shí)米諾環(huán)素組中的VEGF的表達(dá)水平較DAPT組和缺血模型組也同步增高，DAPT+米諾環(huán)素組的VEGF的表達(dá)水平較DAPT組也增高，則說明了米諾環(huán)素可以通過Notch信號(hào)通路來調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)水平，這也說明米諾環(huán)素可以通過Notch信號(hào)通路來增強(qiáng)腦缺血后大腦的血管修復(fù)能力。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了米諾環(huán)素可以通過Notch信號(hào)通路來提高損傷腦組織的血管修復(fù)能力，進(jìn)而發(fā)揮了腦保護(hù)作用，這也為研究米諾環(huán)素發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制向前邁進(jìn)了一步，但同時(shí)也看到了本實(shí)驗(yàn)的一些不足之處，比如Notch有4個(gè)Notch同源基(Notch1-4)和5個(gè)配體(Jagged1/2；Delta1/2/3)，米諾環(huán)素是作用于哪一型還不清楚。另外，米諾環(huán)是否可以通過Notch信號(hào)通路來提高損傷腦組織的神經(jīng)修復(fù)能力本研究沒有涉及，這些問題將在今后的研究中進(jìn)一步的闡釋。