腸道微生物與再生障礙性貧血的相關(guān)性研究

陳小玉 吳亮亮 周睿卿 許艷麗 李孔揚 張玉玲 王順清

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院血液內(nèi)科（廣州 510180）

人類腸道所攜帶的微生物種類繁多，從胃腸道樣本中可檢測出1 000多種腸道微生物，并且數(shù)量巨大，估計每個人的腸道微生物超過104個，約為人體細胞總數(shù)的10倍［1］。腸道微生物間有著微妙的平衡，打破這種平衡，將導(dǎo)致病理免疫反應(yīng)和疾病的發(fā)生［2］。越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物與疾病的發(fā)生有關(guān)。例如，與健康人對比，結(jié)直腸癌早期的志賀氏桿菌、枸櫞酸桿菌屬、沙門氏菌的比例更高［3］；克羅恩病患者中的擬桿菌門比例增加，厚壁菌門比例減低［4］；2型糖尿病患者中，厚壁菌門和梭菌綱所占比例明顯降低，并且擬桿菌門/厚壁菌門的比值與血糖濃度呈正相關(guān)［5］。近年來，腸道微生物與疾病的關(guān)系已成為研究熱點，但再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA），由于發(fā)病率較低及取樣困難，國內(nèi)外尚未報道AA患者的腸道微生物變化情況。AA是一種可能由不同病因和發(fā)病機制引起的骨髓造血功能衰竭癥，主要表現(xiàn)為骨髓造血功能低下、全血細胞減少和貧血、出血、感染綜合征，免疫抑制治療有效［6］。AA診斷標準：（1）全血細胞減少，網(wǎng)織紅細胞百分數(shù)＜1%，淋巴細胞比例增加；（2）一般無肝、脾大；（3）骨髓多部位增生降低（＜正常50%）或重度降低（＜正常25%），造血細胞減少，非造血細胞比例增加，骨髓小?？仗?，且骨髓活檢可見造血組織均勻減少；（4）除外引起全血細胞減少的其他疾病，如PNH、Fanconi貧血、Evans綜合征等。雖然AA的發(fā)病機制至今仍不清楚，但隨著研究的推進，免疫功能異常的理論被越來越多的學(xué)者所認同［7］。腸道微生物在維持宿主免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用，是免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)器［8］。本研究探討與對照組相比，AA患者是否存在腸道微生物異常改變。

1 對象與方法

1.1 研究對象本研究定義初診AA患者為發(fā)病1個月內(nèi)，未口服/靜脈應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑，未接受抗生素治療的AA患者；否則為非初診AA患者。選取2016年12月至2017年12月在廣州市第一人民醫(yī)院進行allo?HSCT治療的48例AA患者進行檢測分析，年齡（28.3±13.1）歲，男28例，女20例。其中12例為初診AA患者，年齡（31.9±9.7）歲，男7例，女5例；36例為非初診AA患者，年齡（27.1±13.97）歲，男21例，女15例。移植方式：親緣人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）10/10全相合13例，親緣HLA9/10相合1例，親緣單倍體17例，非親緣HLA10/10全相合10例，非親緣HLA9/10相合7例。同時選取26例供者及10例健康人均無基礎(chǔ)疾病及3個月內(nèi)未使用任何抗生素，作為對照組，年齡為（29.4±13.5）歲，男22例，女14例。所有研究對象均簽署知情同意書，經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，認定本研究符合醫(yī)學(xué)倫理標準。

1.2 試劑與儀器QIAamp DNA Stool Mini Kit購于德國Qiagen公司；無水乙醇購于廣東汕頭西隴化工公司；DNA BR購于英國Invitrogen公司；瓊脂糖購于瑞士Lonza公司。-80℃冰箱購于美國Thermo公司；低溫高速離心機購于德國Sigma公司；電熱恒溫水浴鍋購于上海精宏實驗設(shè)備有限公司；漩渦混勻器購于德國IKA公司；Qubit Fluorometer購于美國Life儀器；熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；Illumina HiSeq 2500購于美國Illumina公司。

1.3 樣品收集收集48例AA患者以下兩個時間點的糞便樣品并依此分成兩個研究組：（1）移植前組：allo?HSCT前2周，此時尚未預(yù)處理，除了小部分（31.3%）患者移植前合并感染需使用抗生素治療外，大部分（68.7%）患者未接受抗生素治療；（2）移植后組：移植后1個月，此時血常規(guī)大體恢復(fù)正常，AA的免疫紊亂和骨髓衰竭基本被糾正，無感染表現(xiàn)且無需使用抗生素治療。其中有6例AA患者收集了移植后多個時間點的糞便樣品進行檢測，以期探討其腸道微生物動態(tài)變化與AA移植后轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性。另外擇機收集對照組的糞便樣品。

在樣品收集后，新鮮的樣品一開始儲藏在4℃左右，24 h內(nèi)分裝在冷凍管里并在-80℃凍存直至使用。

1.4 DNA提取及測序稱取200 mg糞便于2 mL EP管，具體操作步驟按照QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Germany）試劑盒的使用說明書進行。所有離心步驟應(yīng)該在室溫（15～25℃）、20 000×g（大約14 770 r/min）條件下進行：加入1.4 mL Buffer ASL，渦旋1 min，在95℃下加熱5 min；渦旋15 s并離心1 min，吸取1.2 mL上清液到新的2 mL EP管中，棄去沉淀；加入Inhibit EX Tablet（吸附藥片），渦旋1 min以上至藥片全部懸浮，室溫下孵化1 min；離心3 min，吸取200μL上清液到含有15μL蛋白酶K的1.5 mL EP管中；加入200μL Buffer AL，渦旋15 s，在70℃孵育10 min；加入200μL無水乙醇，渦旋混勻，得到裂解產(chǎn)物；把全部裂解產(chǎn)物涂抹在QIAamp純化柱上，離心1 min；把QIAamp純化柱放入新的2 mL收集管中，加入500μL Buffer AW1，離心3 min；把QIAamp純化柱放入新的2 mL收集管中，加入500μL Buffer AW2，離心3 min；將QIAamp純化柱放入新的1.5 mL EP管中，加入200μL Buffer AE，室溫孵化1 min，然后離心1 min以洗脫DNA。提取后的DNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并用Qubit Fluorometer檢測DNA的濃度。

用通用引物515F（5′?GTGCCAGCMGCCGCGG?TAA）、806R（5′?GGACTACHVGGGTWTCTAAT）擴增細菌16SrRNA的V4可變區(qū)，其擴增產(chǎn)物在Illu?mina HiSeq 2500平臺測序。測序下機數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，濾除低質(zhì)量的reads，剩余高質(zhì)量的Clean reads方可用于后期分析；通過reads之間的Overlap關(guān)系將reads拼接成Tags；在97%的相似度下將Tags聚成 operational taxonomic units（OTU），然后通過OTU與Greengenes 16S參考數(shù)據(jù)庫比對，對OTU進行物種門、綱、目、科、屬和種水平的注釋，基于OTU進行主成分分析和韋恩圖分析；基于物種注釋結(jié)果進行樣品組間物種差異分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，2組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示，2組間數(shù)據(jù)比較采用Mann?WhitneyU檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果總共獲得132個糞便樣品，平均每個樣品產(chǎn)生52 567條Tags，Tag平均長度為252 bp，共得到6 938 880條Tags，共產(chǎn)生1 385個OTU。

2.2 AA患者腸道微生物的主成分分析從主成分分析中可以看出對照組、移植前組和移植后組之間表現(xiàn)出分散的分布情況，說明這3組樣品間物種組成有一定的差異（圖1）。

圖1 主成分分析Fig.1 Principal component analysis

2.3 AA患者腸道微生物的韋恩圖分析在97%的相似度下，得到了每個樣品的OTU個數(shù)，利用韋恩圖可以展示多組樣品共有和各自特有OTU數(shù)目，直觀展示樣品組間OTU的重疊情況。結(jié)合OTU所代表的物種，可以找出不同組間的共有微生物（圖2）。

圖2 韋恩圖分析Fig.2 Venn diagram analysis

2.4 AA患者的腸道微生物變化圖3展示了每個樣品分別在門、綱、目、科、屬、種水平的物種profiling柱狀圖，A1～A36為對照組樣品；B1～B48為移植前樣品；C1～C48為移植后樣品。從圖中可以直觀看出不同物種在每個樣品中所占的比例。移植前初診AA患者組與對照組分別在門、綱、目、科、屬和種分類水平中進行共有微生物的比較，發(fā)現(xiàn)除了科分類水平的毛螺菌科比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義外，其他分類水平物種比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；同樣，在移植前非初診AA組也是如此。因此隨后本研究主要分析AA患者移植治療前后毛螺菌科的變化情況。

在移植前，初診AA組毛螺菌科相對豐度中位數(shù)為6.91%，比對照組毛螺菌科相對豐度（11.27%）降低（P=0.039）；非初診AA組毛螺菌科相對豐度為7.31%，也比對照組毛螺菌科降低（P=0.010）；但初診組與非初診組之間毛螺菌科相對豐度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.835）；于是將兩組合并統(tǒng)稱為移植前組，毛螺菌科相對豐度為7.20%，比對照組毛螺菌科降低（P=0.005）（圖4）。

再來對比分析移植前后毛螺菌科的變化情況，移植后組毛螺菌科相對豐度為9.39%，與移植前組毛螺菌科相比，有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.658）；移植后組毛螺菌科相對豐度與對照組相比，差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.061）（圖5）。

圖3 每個樣品分別在門、綱、目、科、屬、種水平的物種profiling柱狀圖Fig.3 The taxonomics composition distribution profiling histograms of each sample were shown at Phylum，Order，Class，F(xiàn)amily，Genus，Species level separately

2.5 初步探討再生障礙性貧血患者移植過程中毛螺菌科變化由圖6可見4例allo?HSCT術(shù)后血象基本恢復(fù)正常的AA患者，毛螺菌科水平整體呈上升趨勢，但在觀察期間內(nèi)尚未見到上升的平臺期。2例allo?HSCT術(shù)后1個月血象基本恢復(fù)正常，毛螺菌科水平較移植前升高，但之后血象全面下降，DNA指紋圖檢查提示嵌合率下降，考慮出現(xiàn)繼發(fā)性移植物排斥，同時毛螺菌科水平也明顯降低（表1）。

圖4 不同組間毛螺菌科的比較Fig.4 Comparison of Lachnospiraceaeamong different groups

圖5 不同組間毛螺菌科的比較Fig.5 Comparison of Lachnospiraceaeamong in different groups

圖6 移植后6例患者毛螺菌科的變化情況Fig.6 The changes of Lachnospiraceae in 6 patients after transplantation

表1 血象、嵌合率與毛螺菌科的動態(tài)變化Tab.1 The dynamic changes of bloodroutine,chimerismratioand Lachnospiraceae

3 討論

腸道微生物現(xiàn)在被認為是人類最重要的微生態(tài)系統(tǒng)，其像一個器官，具備代謝、免疫和內(nèi)分泌等多種生理功能，通過共同進化，宿主不僅可以耐受，而且還形成與微生物互惠互利的關(guān)系［9］。腸道微生物的相互作用是復(fù)雜的和流動的，能夠適應(yīng)每天遇到的生理擾動，然而，由于宿主的飲食、藥物和其他環(huán)境因素的影響，腸道微生物群大量的或者有選擇性的改變會擾亂微生物內(nèi)部和宿主-微生物之間的關(guān)系，從而引發(fā)疾病的病理生理過程［10］。在這項研究中，與對照組的腸道微生物相比，初診AA患者組和移植前組毛螺菌科的相對豐度降低。微生物的分類依據(jù)是生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能等方面的相似性，根據(jù)微生物的分類，毛螺菌科屬于厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目。CD4+CD25+FOXP3+regulatory Tcell（Treg）細胞在腸道穩(wěn)定狀態(tài)時非常豐富，并且有助于維持腸道和免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。從健康人類糞便樣品中分離出來的梭菌綱（包括毛螺菌科）會影響Treg細胞的數(shù)量和功能；在小鼠的動物模型中，口服梭菌綱菌株可以減輕小鼠結(jié)腸炎和過敏性腹瀉的癥狀。最近有研究表明，毛螺菌科的相對豐度與Treg/Th17細胞數(shù)比值呈正相關(guān)，并且與CD4+T細胞內(nèi)乙?；M蛋白H3的中位熒光強度水平呈正相關(guān)，該研究推測毛螺菌科可能通過調(diào)節(jié)CD4+T細胞內(nèi)乙酰化組蛋白H3水平，調(diào)控Treg/Th17的免疫平衡［11］。Treg細胞為具有免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細胞亞群，其具有免疫抑制功能，參與多種自身免疫性疾病的病理生理過程。最近的研究表明，AA是一種由自身反應(yīng)性T細胞介導(dǎo)的以攻擊骨髓為主要靶器官的骨髓造血功能衰竭癥，Treg細胞在AA的病理生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［12］。Treg細胞幾乎在所有的AA患者中都是減少的，并且FOXP3的蛋白和mRNA水平及NFAT1的蛋白水平也是減少的甚至缺失的，低水平的NFAT1可能導(dǎo)致低FOXP3的表達；Treg細胞的缺失可以增強自身反應(yīng)性T細胞的產(chǎn)生和AA的發(fā)展。AA患者外周血和骨髓中Treg細胞出現(xiàn)的頻率均降低，因為CXCR4（而不是CXCR7）的低表達導(dǎo)致AA患者外周血Treg細胞的遷移能力受損，此外，AA患者Treg細胞抑制由效應(yīng)T細胞產(chǎn)生的INF?γ的能力下降［12］。AA患者骨髓間充質(zhì)干細胞由于TGF?β減少促使Treg細胞增殖缺陷，Treg細胞數(shù)量減少導(dǎo)致免疫內(nèi)環(huán)境紊亂并進一步加劇骨髓衰竭［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，AA患者血紅蛋白計數(shù)與外周血Treg細胞表達呈正相關(guān)，即Treg細胞數(shù)量與AA患者貧血程度密切相關(guān)［14］。AA患者毛螺菌科的降低可能與Treg細胞的數(shù)量和功能相關(guān)，并且可能參與AA的病理生理過程。

本研究發(fā)現(xiàn)初診AA患者與非初診AA患者（即接受過免疫抑制、抗生素等治療的患者）毛螺菌科相對豐度相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？股亍⒚庖咭种苿┑纫苍S對毛螺菌科的影響較少，但本研究的病例數(shù)較少，還需更多的初診AA患者進一步驗證此猜測。經(jīng)過allo?HSCT治療1個月后，AA患者毛螺菌科水平雖然與移植前組相比差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義（可能與樣本量不足有關(guān)），但移植后毛螺菌科水平整體呈上升趨勢，且與對照組毛螺菌科之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由圖6可見allo?HSCT治療后毛螺菌科水平整體呈上升趨勢，且與移植后血象的動態(tài)變化相一致，即移植后血象穩(wěn)定的患者毛螺菌科逐步上升，移植后血象下降的患者毛螺菌科也隨之降低，但在本研究期間內(nèi)，尚未見到毛螺菌科上升的平臺期。

綜上所述，毛螺菌科相對豐度的降低可能與AA相關(guān)，抗生素、免疫抑制劑等也許對毛螺菌科的影響較少，allo?HSCT術(shù)后AA的免疫紊亂和骨髓衰竭基本被糾正時，毛螺菌科水平整體呈上升趨勢。毛螺菌科與AA之間的關(guān)系也許會導(dǎo)致對AA發(fā)病機制的新認識，今后可以擴大研究的病例數(shù)，進一步探討造血干細胞移植過程中毛螺菌科的動態(tài)變化過程并尋找毛螺菌科恢復(fù)正常的時間點，同時評估AA患者毛螺菌科變化是否與Treg細胞，尤其是Treg/Th17的免疫平衡相關(guān)。