IFN?γ通過下調(diào)PD?1和PD?L2信號通路拮抗CD33來干預(yù)肺結(jié)核發(fā)展的機(jī)制

張艷麗 楊衛(wèi) 武麗 李福建 張貴賢

1保定市傳染病醫(yī)院結(jié)核科（河北保定 071000）；2保定市第一中心醫(yī)院呼吸科（河北保定 071000）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）每年導(dǎo)致860萬新病例和170萬人死亡［1］。表達(dá)IFN?γ的Th1細(xì)胞和產(chǎn)生IL?17的Th17細(xì)胞在控制結(jié)核感染中起關(guān)鍵作用。最近，髓系來源的抑制性細(xì)胞（MDSC）與T細(xì)胞反應(yīng)的不平衡相關(guān)并參與TB的疾病進(jìn)展。MDSC具有抑制T細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)大能力。MDSCs可分為兩類：顯示CD14?CD15+CD11b+CD33+HLA?DRlow/-表型的粒細(xì)胞MDSCs和具有CD14+CD15?CD11b+CD33+HLA?DRlow/-表達(dá)的單核細(xì)胞MDSCs［2］。高度抑制的MDSC通過細(xì)胞—細(xì)胞相互作用發(fā)揮其功能，包括共刺激/抑制分子如B7?H1（PD?L1）、B7?H3［3］、CD40和CD80。在IFN?γ存在的情況下通過GM?csf和IL?6體外產(chǎn)生人CD33+MDSC可用作鑒定IFN?γ的功能。

1 對象與方法

1.1 研究對象活動性肺結(jié)核（LTBI）患者120例，LTBI患者80例，健康體檢者40例。所有參與者都是成年人，不包括孕婦和兒童。肺結(jié)核的診斷基于陽性痰涂片和（或）培養(yǎng)結(jié)果和胸片。對于細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陰性的患者，通過胸片、臨床癥狀確診，經(jīng)抗結(jié)核化療后癥狀改善和影像學(xué)改善。健康人從本院進(jìn)行健康體檢隨機(jī)抽取。健康個(gè)體篩選標(biāo)準(zhǔn)：（1）無發(fā)熱，咳嗽或其他活動性結(jié)核體征；（2）體格檢查結(jié)果正常，X線正常；（3）TST檢查，T?SPOT陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤，HIV感染或攝入免疫抑制劑的個(gè)體。

1.2 體外產(chǎn)生人類MDSC通過聚蔗糖梯度離心從健康個(gè)體分離PBMC，并在含有10%FBS（Sigma Aldrich，Munich，Germany），2 mmol谷氨酰胺，100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI?1640培養(yǎng)基。為了產(chǎn)生功能性MDSC，在重組人細(xì)胞因子GM?csf，IL?6（10 ng/mL）和 IFN?γ（10 ng/mL）（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）的存在下，在完全培養(yǎng)基中以5×105個(gè)細(xì)胞/mL在T?25燒瓶中培養(yǎng)PBMC 7 d。用單獨(dú)培養(yǎng)基和單核細(xì)胞培養(yǎng)的PBMC［通過磁性活化細(xì)胞分選抗CD14微珠（BD Pharmingen）分離］用作對照。培養(yǎng)操作重復(fù)運(yùn)行。培養(yǎng)基和細(xì)胞因子每3天進(jìn)行一次。1周后，收集所有細(xì)胞并除去貼壁細(xì)胞。通過FACSAria細(xì)胞分選儀（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）分離CD33+或CD33+HLA?DR+/-細(xì)胞。

在BD LSRFortessa流式細(xì)胞儀（BD Bioscienc?es，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA）上測量細(xì)胞并使用Facs Diva軟件（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）進(jìn)行分析。使用FlowJo軟件（Tree Star Inc，Ash?land，OR，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)分離的細(xì)胞群的純度為90%。

1.3 流式細(xì)胞儀為了表面染色，收獲PBMC，洗滌并用熒光綴合的mAbs或同種型匹配的對照的混合物在冰上染色30 min。MDSC的表型通過CD11b（ICRF44），CD33（WM53），HLA?DR（G46?6），CD14（MφP9），CD15（W6D3），CD80（BB1），CD86（2331），PD?L1（MIH1）和PD?L2（MIH18）的表達(dá)來評估。通過CD4（RPA?T4），CD8（RPA?T8），HLA?DR（L243），CD25（M?A251）和 CD69（FN50）（均來自BDPharmingen）來評估T細(xì)胞的表面表達(dá)。對于細(xì)胞內(nèi)染色，在brefeldin A（eBioscience）存在下用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA）和伊屋諾霉素（Invitrogen，Carlsbad，CA）模擬細(xì)胞4 h，然后收獲。表面染色后，將細(xì)胞固定，透化并用IFN?γ（B27），F(xiàn)oxp3（236A/E7）和相應(yīng)的同種型對照（BD Pharmingen）染色。用膜聯(lián)蛋白V（BD Pharmingen）和PI（BD Pharmingen）染色檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞死亡。在流式細(xì)胞儀（BD LSRFortessa）（BD Biosci?ences）上通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表型。數(shù)據(jù)是作為活細(xì)胞門內(nèi)設(shè)置的50 000個(gè)事件中標(biāo)記細(xì)胞的分?jǐn)?shù)獲得的，并使用FlowJo軟件（Tree Star）進(jìn)行分析。

1.4 T細(xì)胞抑制測定分選CD33+或CD33+HLA?DR+/-細(xì)胞的抑制功能通過在下列抑制測定中抑制自體T細(xì)胞增殖的能力來測定。通過抗-CD3微珠和磁性柱分離（Miltenyi Biotec）從PBMC分離的T細(xì)胞被CFSE標(biāo)記（5 μmol/L，Sigma?Aldrich），并以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔平板中。先前從細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)分離的CD33+或CD33+HLA?DR+/-與CD3+T細(xì)胞以1∶4，2∶4和4∶4的比率共培養(yǎng)。通過抗CD3/CD28（1 μg/mL）和IL?2（50 U/mL；R＆D Systems）誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖。3 d后分析CD4+或CD8+T細(xì)胞的增殖。對于所指出的研究，將FACS分選的抑制細(xì)胞與T細(xì)胞在下列抑制劑存在下共培養(yǎng)：10 mmol/L NG?單甲基-L-精氨酸（L?NMMA），100 μmol/L N?羥基-正-L-精氨酸（NOHA）（Sigma?Aldrich）和 10 μg/mL抗 PD?1和IgG對照（R&D Systems）。以15 000個(gè)事件的活淋巴門控細(xì)胞的增殖百分比獲得數(shù)據(jù)。

1.5 T細(xì)胞的增殖原代CD4+T細(xì)胞（CD4+CD45RO?CD62LhiCD25?）由 PBMC 陰性選擇磁珠（BD Pharmingen）純化，分離的T細(xì)胞群的純度為95%。在Th1或Treg傾斜條件下，在96孔U形底板中以1×105個(gè)細(xì)胞/mL切下初始CD4+T細(xì)胞。Th1 條件：在 IL?12（10 ng/mL）和 IFN?γ（10 ng/mL）存在下用平板結(jié)合的抗CD3（4μg/mL），抗CD28（1μg/mL）刺激初始T細(xì)胞。5 d后，用重組IL?2（50 U/mL）（BD Pharmingen）補(bǔ)充培養(yǎng)物。Treg條件：在TGF?β（5 ng/mL）和IL?2（10 ng/mL），抗IFN?γ（10μg/mL）和抗IL?4（10μg/mL）存在下，用平板結(jié)合的抗-CD3（4 μg/mL），抗-CD28（1 μg/mL）刺激初始T細(xì)胞。培養(yǎng)基每3天添加一次細(xì)胞因子和中和抗體。第7天，在IL?2（10 ng/mL）存在下收獲細(xì)胞，洗滌，計(jì)數(shù)并與先前分離的CD33+HLA?DR+細(xì)胞以1∶1的比率共培養(yǎng)。第12天，分析細(xì)胞的IFN?γ產(chǎn)生和FoxP3表達(dá)。

1.6 Transwell分析從細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)分離的CD33+HLA?DR+/-細(xì)胞在抗CD3/CD28（1 μg/mL）和IL?2（10 ng/mL）存在下與自體CFSE標(biāo)記的CD3+T細(xì)胞以1∶2的比率共培養(yǎng)3 d。當(dāng)將CD3+T細(xì)胞置于上Transwell室（Costar?Corning，Amsterdam，The Netherlands）時(shí)，將 CD33+HLA?DR+/-細(xì)胞置于下Transwell室中。

1.7 一氧化氮（NO）按照制造商的方案（Promega，Madison，WI）測量血漿中的NO含量。將等體積的上清液（50μL）與Greiss試劑A和B混合，并在室溫下避光孵育10 min。使用酶標(biāo)儀（Bio?Rad，Hercules，CA）測量550 nm處的吸光度。通過比較測試樣品的吸光度值與通過連續(xù)稀釋0.25 mmol/L亞硝酸鈉產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定亞硝酸鹽濃度。

1.8 精氨酸酶活性測定在來自分離的CD33+HLA?DR+細(xì)胞的細(xì)胞裂解物中測量精氨酸酶的活性［33］。簡而言之，將細(xì)胞用0.1%Triton X?100裂解30 min，隨后加入25 mmol/L TrisHCl。通過在56℃加熱10 min使酶活化。通過將裂解物與0.5 M L-精氨酸和10 mmol/L MnCl2在37℃孵育120 min進(jìn)行精氨酸水解。加入α-異亞硝基苯丙酮（溶于100%乙醇）后，在95℃加熱30 min，用酶標(biāo)儀（Bio?Rad）在540 nm處測量尿素濃度。基于連續(xù)稀釋的尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算尿素含量（以上使用的藥劑均來自德國慕尼黑的西格瑪奧德里奇公司）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分別使用GraphPad Prismversion 5.0和SPSS Statistics 17.0，通過單因素方差分析（ANOVA）和Kruskal?Wallis檢驗(yàn)評估臨床患者中MDSC水平的變化。如果發(fā)現(xiàn)顯著差異，則進(jìn)行學(xué)生t檢驗(yàn)以分析組之間的差異。使用Spearman秩和檢驗(yàn)分析不同參數(shù)之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核病患者外周血單核細(xì)胞MDSCs水平升高與HC相比，在TB患者中清楚地觀察到HLA?DR-/lowCD11b+CD33+MDSCs的顯著更高的群體。MDSCs主要是CD14陽性而不是CD15陽性。LTBI患者的MDSCs水平顯著高于HC患者，未經(jīng)治療的活動性結(jié)核病患者的MDSCs水平高于LTBI患者，接受抗結(jié)核治療的結(jié)核病患者中MDSCs的頻率顯著降低。見圖1。

圖1 MDSCs在結(jié)核病患者中的擴(kuò)展Fig.1 The expansion of MDSCs in tuberculosis patients

2.2 MDSC頻率與Th1的百分比呈負(fù)相關(guān)在HC中檢測到較低水平的IFN?γ或產(chǎn)生IL?17的CD4+T細(xì)胞。同時(shí)，在M.tb肽刺激后MDSCs的百分比顯著降低。MDSCs百分比與結(jié)核病患者Th1頻率成反比。見圖2。

2.3 GM?csf和IL?6誘導(dǎo)的CD33+HLA?DRlow細(xì)胞抑制T細(xì)胞增殖功能性CD33+MDSC樣細(xì)胞是HLA?DR+細(xì)胞而不是 HLA?DR?細(xì)胞。當(dāng)與 HLA?DR高單核細(xì)胞比較時(shí)，CD33+HLA?DR+MDSC樣細(xì)胞幾乎是HLA?DR低表型。與配對的CD33+HLA?DR細(xì)胞相比，GM?csf和IL?6誘導(dǎo)的CD33+HLA?DRlow細(xì)胞能夠以劑量依賴的方式抑制自體T細(xì)胞的增殖。見圖3。

2.4 IFN?γ受體CD33+HLA?DRlow MDSCs表現(xiàn)出抑制功能下降GM?csf和IL?6誘導(dǎo)的CD33+HLA?DRlowMDSC與相應(yīng)的IFN?γ受體化的MDSC相比，具有更強(qiáng)的抑制自體T細(xì)胞的能力。而CD33+HLA?DR-細(xì)胞顯示非抑制活性。與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CD33+HLA?DRlowMDSC共培養(yǎng)后，分析自體CD3+T細(xì)胞上CD69，CD25和HLA?DR的活化標(biāo)志物的表達(dá)。IFN?γ-培養(yǎng)的CD33+HLA?DRlowMDSC抑制T細(xì)胞活化程度較低，而GM?csf和IL?6誘導(dǎo)的CD33+HLA?DRlowMDSC顯著抑制自體T細(xì)胞的活化。見圖4。

圖2 MDSC頻率與Th1在TB患者中呈負(fù)相關(guān)Fig.2 MDSCfrequency was negatively correlated with Th1 in TBpatients

圖3 IFN?γ教育抑制CD33+HLA?DRlow MDSC抑制T細(xì)胞增殖Fig.3 IFN?γ educate inhibition CD33+HLA?DRlow MDSCinhibition of T cell proliferation

細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分析表明，受IFN?γ培養(yǎng)的CD33+HLADRlowMDSC在較小程度上阻礙產(chǎn)生IFN?γ的 CD4+T，而 GM?csf和 IL?6誘導(dǎo)的 CD33+HLA?DRlowMDSC顯著抑制CD4+T細(xì)胞中的IFN?γ產(chǎn)生。此外，GM?csf和IL?6誘導(dǎo)的CD33+HLA?DRlowMDSCs與IFN?γ?受體相比誘導(dǎo)更高水平的FoxP3+CD4+T細(xì)胞。

3 討論

MDSCs與人類結(jié)核感染的進(jìn)展密切相關(guān)，MD?SCs在活動性結(jié)核病患者以及LTBI患者的外周血中均有擴(kuò)增［4-6］。此外，藥物治療減少了MDSC的積累。有證據(jù)表明MDSCs可以作為結(jié)核病治療反應(yīng)的標(biāo)志物。有趣的是，最近接觸結(jié)核病的結(jié)核菌素皮試（TST）（+）個(gè)體中MDSC的頻率高于遠(yuǎn)程接觸結(jié)核病?；顒有越Y(jié)核病患者的MDSC比具有LTBI的患者具有更廣泛的抑制作用。MDSCs的蓄積和功能與病原菌的加載或炎癥微環(huán)境有關(guān)。MDSC功能與病原體負(fù)載無關(guān)，盡管它們能夠攝取M.tb。鑒于MDSCs有較高可塑性，筆者設(shè)想在M.tb慢性炎癥過程中微環(huán)境中的免疫介質(zhì)可影響MDSCs的積累和功能。具有潛伏感染的個(gè)體通常獲得有效的T細(xì)胞應(yīng)答保護(hù)，而患有活動性結(jié)核病，晚期或播散性疾病的患者缺乏有效的T細(xì)胞免疫［7-9］。同抑制效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)與活躍性結(jié)核或播散性疾病中MDSCs的旺盛擴(kuò)增有關(guān)［10］。本研究顯示，MDSCs的擴(kuò)增與IFN?γ+CD4+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。眾所周知MDSCs能夠抑制IFN?γ+CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生。

圖4 IFN?γ教育抑制CD33+HLA?DRlow MDSCs抑制T細(xì)胞活化Fig.4 IFN?γ educate inhibition CD33+HLA?DRlow MDSCs from inhibiting Tcell activation

IFN?γ最近被認(rèn)為是MDSC擴(kuò)增和小鼠免疫抑制功能的基本分子［11-12］。一方面，據(jù)報(bào)道，IFN?γ通過降低抗凋亡蛋白Bcl2a的表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)粒細(xì)胞-MDSC的存活，并連續(xù)抑制粒細(xì)胞-MDSC的抑制功能，阻斷IFN?γ直接損害單核細(xì)胞-MDS的抑制功能［13-15］。另一方面，在具有 IFN?γ-或 IFN?γR-/-腫瘤的小鼠中，MDSC的表型，積累和抑制功能與來自野生型小鼠的相似物類似，表明IFN?γ不是MDSC的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。表明IFN?γ處理將人腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）從免疫抑制轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖叽碳ぜ?xì)胞并阻止TAM從其前體產(chǎn)生。到目前為止，關(guān)于IFN?γ對人MDSC的影響知之甚少。來自健康個(gè)體的IFN?γ-培養(yǎng)的CD33+HLA?DRlowMDSC比GM?csf和IL?6-誘導(dǎo)的CD33+HLADRlowMDSC具有更少的抑制性質(zhì)，作為T細(xì)胞活化，增殖和IFN?γ產(chǎn)生的恢復(fù)以及Treg誘導(dǎo)減少的證據(jù)。故IFN?γ抑制了人類MDSCs的抑制功能。由GM?csf和IL?6誘導(dǎo)的MDSC產(chǎn)生的免疫抑制的唯一子集是CD33+HLA?DRlow細(xì)胞群，和CD33+HLA?DR-細(xì)胞完全沒有抑制活性。抑制性活動可能不是MDSCs的穩(wěn)定特征，而是暫時(shí)的狀態(tài)，這將由MDSCs遷移的微環(huán)境中的本地信號改變。

圖5 IFN?γ教育抑制CD33+HLA?DRlow MDSC抑制Th1應(yīng)答并且促進(jìn)Treg擴(kuò)展Fig.5 IFN?γ educate inhibition CD33+HLA?DRlow MDSCinhibitis of Th1 responses and promotes Treg expansion

本研究表明，CD33+HLA?DRlowMDSC的免疫抑制活性通過阻斷PD?1而顯著減少，CD33+HLA?DRlowMDSC的免疫抑制功能是PD?1/PD?Ls途徑依賴性的。然而，PDL1在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的MDSC中的可比較的表達(dá)水平不能支持PD?L1在受IFN?γ培養(yǎng)的抑制性較弱的MDSC上的作用。PD?L1的中和不會消除未治療的慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者外周血中PD?L1hiCD11b+CD33+CD14+HLA?DR1單核細(xì)胞MDSCs的免疫抑制功能。值得注意的是，盡管PD?L1可能是顯性負(fù)抑制分子，但PD?L2被認(rèn)為是可能的第二重要抑制分子。PD?L2與PD?1的相對親和力高于PD?L1，因此如果PD?L1在相同水平上表達(dá)，PD?L1與PD?L1結(jié)合的能力會超出PD?L1。因此，與IFN?γ-受教育的CD33+HLA?DRlowMDSC相比，更高水平的PD?L2負(fù)責(zé)GM?csf和IL?6誘導(dǎo)的CD33+HLA?DRlowMDSC更強(qiáng)的抑制功能。

綜上所述，MDSCs的積累與TB的疾病進(jìn)展有關(guān)。此外，M.tb感染誘導(dǎo)了一個(gè)適當(dāng)?shù)奈h(huán)境來驅(qū)動MDSCs的積累，其抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)以促進(jìn)持續(xù)感染。而且，產(chǎn)生IFN?γ的細(xì)胞通過抑制細(xì)胞-細(xì)胞接觸介導(dǎo)的免疫抑制來抑制MDSC的抑制活性，從而增強(qiáng)了抗分枝桿菌反應(yīng)以控制疾病進(jìn)展。