維生素E琥珀酸酯聯(lián)合5-氟尿嘧啶和5′-脫氧氟脲苷促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡

王綺雯 張繼民 李愛(ài)群 鄒湘才

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1外科實(shí)驗(yàn)室，2胃腸外科，3心研所（廣州 510260）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)的病死率中，結(jié)直腸癌處于第3位［1］。由于生活方式的改變，近年我國(guó)的結(jié)直腸癌總體發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。雖然CRC的診斷和治療均取得了較快發(fā)展，但CRC的治療仍然以外科手術(shù)為主，許多患者因早期癥狀不明顯導(dǎo)致就診時(shí)已屬中晚期，預(yù)后較差［2］。如何提高CRC患者生存質(zhì)量已成為臨床研究的熱點(diǎn)。目前結(jié)腸癌的治療是以手術(shù)為主的綜合治療，而輔助化療已成為綜合治療的重要組成部分。臨床上常用的化療方案多以5-氟尿嘧啶（5?FU）為基礎(chǔ)，5?FU作為臨床上用于消化道惡性腫瘤化療的主要藥物，因有明顯的副作用受到限制。近年推出了具有較少毒副作用、無(wú)直接細(xì)胞毒性的 5?FU 前體藥物，如 5′-脫氧氟脲苷（5′?DFUR）、卡培他濱等。

維生素E琥珀酸酯（vitamin E succinate，VES）是天然維生素E的衍生物，近年因具有抗腫瘤功效而備受關(guān)注。研究［3］證明VES具有促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒副作用。無(wú)毒副作用的VES聯(lián)合臨床常用的化療藥物5?FU、5′?DFUR，能否增強(qiáng)5?FU、5′?DFUR的化療作用，成為臨床的輔助化療藥呢？本文擬通過(guò)VES分別聯(lián)合5?FU、5′?DFUR，觀察其對(duì)人結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞的影響，旨在闡明VES分別聯(lián)合5?FU、5′?DFUR誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，為探索更多結(jié)腸癌輔助化療的聯(lián)合化療方案提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要實(shí)驗(yàn)試劑人結(jié)腸癌細(xì)胞系LS174T購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。VES、5?FU和5′?DFUR購(gòu)于Sigma公司，胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)液購(gòu)于Gibco公司。MTS（四唑化合物）粉劑購(gòu)于promega公司。Annexin V?FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于聯(lián)科生物。Bid、Bax抗體購(gòu)于生工生物，bcl?2抗體購(gòu)于博士德生物。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理LS174T細(xì)胞用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基體外常規(guī)培養(yǎng)。VES用無(wú)水乙醇溶解配制成25 mmol/L的儲(chǔ)備液，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度；5?FU和5′?DFUR用完全培養(yǎng)基溶解配制成3 mg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)再用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3 MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況將LS174T細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加100μL含2×103個(gè)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，接種3板，每板鋪60個(gè)孔，外周孔中加入200μL無(wú)菌PBS。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入用完全培養(yǎng)基稀釋的 VES、5?FU 與 5′?DFUR，使 VES最終濃度為60、40、30、20、15、10、7.5、5、2.5 μmol/L，5?FU最終濃度為 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μmol/L，5′?DFUR 最終濃度為 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μmol/L，同一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，正常組加入不含藥物的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入40μL DPBS緩沖液溶解的MTS與PMS的混合物（20∶1），37℃繼續(xù)孵育4 h后，在490 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)量每孔吸光度值（A490），選擇出VES 、5?FU與5′?DFUR的最大無(wú)毒劑量。最大無(wú)毒劑量VES分別與最大無(wú)毒劑量5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用，重復(fù)上述MTS實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞的影響。

1.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)6孔培養(yǎng)板中，每孔加1 mL含5×105個(gè)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用完全培養(yǎng)基稀釋VES 、5?FU與5′?DFUR，使其終濃度為0，20 μmol/L VES，1 μmol/L 5?FU，2 μmol/L 5′?DFUR，20 μmol/L VES+1 μmol/L 5?FU，20 μmol/L VES+2 μmol/L 5′?DFUR。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞 Bid、Bax、bcl?2 的表達(dá)收集不同處理組的細(xì)胞，常規(guī)裂解，提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，等量上樣，SDS?PAGE電泳分離，低溫轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉，加入一抗4℃搖床過(guò)夜，洗膜后加入用相應(yīng)的二抗，室溫?fù)u床放置1 h。洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色并對(duì)圖像進(jìn)行拍照和分析。

1.6 流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集不同處理組處理24 h后的細(xì)胞，4℃預(yù)冷PBS洗2次，用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/mL。取100μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5μL Annexin V?FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，室溫條件下避光反應(yīng)15 min，最后加入400μL預(yù)冷的PBS，流式細(xì)胞儀（FACS）分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗(yàn)，3組以上組間比較均采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VES、5?FU與5′?DFUR的最大無(wú)毒劑量分別以不同濃度的 VES、5?FU 與 5′?DFUR 處理LS174T細(xì)胞24 h，MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，VES 、5?FU與5′?DFUR對(duì)細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈量效關(guān)系，其最大無(wú)毒劑量分別為20μmol/L、1 μmol/L、2μmol/L（見(jiàn)表1）。

2.2 最大無(wú)毒劑量VES、5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞增殖的影響V ES最大無(wú)毒劑量（20μmol/L）分別與5?FU最大無(wú)毒劑量（1 μmol/L）、5′?DFUR最大無(wú)毒劑量（2μmol/L）聯(lián)合作用，MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，與正常組、VES組相比，VES+5?FU組與VES+5′?DFUR組的細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05）。由此說(shuō)明，VES能增強(qiáng)5?FU、5′?DFUR抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用，特別是VES與5′?DFUR聯(lián)合作用效果尤為顯著（見(jiàn)表2）。

2.3 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)LS174T細(xì)胞接著于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)，分6組（0，20μmol/L VES，1 μmol/L 5?FU，2 μmol/L 5′?DFUR，20 μmol/L VES+1 μmol/L 5?FU，20 μmol/L VES+2 μmol/L 5′?DFUR）處理24 h。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，正常組與VES組細(xì)胞呈梭形，折光性良好，胞質(zhì)飽滿，核質(zhì)清晰，細(xì)胞之間連接緊密；1 μmol/L 5?FU、2 μmol/L 5′?DFUR組細(xì)胞呈梭形，有些細(xì)胞兩端出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的偽足，折光性較好，胞質(zhì)比較飽滿，核質(zhì)較清晰，細(xì)胞間距增加，有少量死細(xì)胞。聯(lián)合作用的兩組細(xì)胞（20μmol/L VES+1μmol/L 5?FU，20μmol/L VES+2 μmol/L 5′?DFUR）細(xì)胞呈圓形，折光性明顯變差，胞質(zhì)飽滿度較差，核質(zhì)不清晰，細(xì)胞間距增加，死亡細(xì)胞明顯增多。

表1 不同濃度VES5、5?FU、5′?DFUR對(duì)LS174T細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effects of different concentrations of VES，5?FU，5′?DFUR on proliferation of LS174Tcells（n=6）

表2 VES與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對(duì)LS174T細(xì)胞增殖的影響Tab.2 Effects of VEScombined with 5?FU，5 ′?DFUR on proliferation of LS174Tcells

2.4 VES分別與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（bid、bax、bcl?2）表達(dá)的影響LS174T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，同2.3分組處理細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中bid、bax、bcl?2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，20 μmol/L VES，1 μmol/L 5?FU，2 μmol/L 5′?DFUR處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中 bid、bax、bcl?2的蛋白表達(dá)與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；20 μmol/L VES+1 μmol/L 5?FU，20 μmol/L VES+2 μmol/L 5′?DFUR作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中bid、bax的蛋白表達(dá)明顯高于正常組與VES組，bcl?2明顯低于正常組與VES組（P＜0.05）（見(jiàn)圖2）。

圖1 VES與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響（× 100）Fig.1 Effects of VEScombined with 5?FU，5′?DFUR on cell morphology（× 100）

2.5 VES分別與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對(duì)LS174T細(xì)胞凋亡的作用同2.3分組處理LS174T細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，與正常組、VES組相比，VES+5?FU組（35.93± 2.78）%與VES+5′?DFUR組（55.50± 0.95）%的凋亡率明顯升高（P＜0.05）；5?FU組（7.90 ± 0.75）%與5′?DFUR組（4.53±0.45）%的凋亡率也有所升高（P＜0.05），但升高的幅度沒(méi)有聯(lián)合作用組大。其中，VES+5′?DFUR 組凋亡率最高，說(shuō)明 VES 與 5′?DFUR聯(lián)合作用的效果最為顯著（見(jiàn)圖3、表3）。

圖2 VES分別與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對(duì)bid、bax、bcl?2表達(dá)的影響Fig.2 Effects of VEScombined with 5?FU，5′?DFUR on bid，Bax and bcl?2 expression

圖3 VES分別與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對(duì)LS174T細(xì)胞的凋亡作用Fig.3 Effects of VEScombined with 5?FU and 5′?DFUR on the apoptosis of LS174Tcells

表3 VES與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用對(duì)LS174T細(xì)胞凋亡的影響Tab.3 Effects of VEScombined with 5?FUand 5′?DFUR on the apoptosis of LS174Tcells

3 討論

近年來(lái)，隨著環(huán)境污染日益嚴(yán)重以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率與病死率加速上升，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康。目前，結(jié)腸癌治療是以手術(shù)治療為主的綜合治療，輔助化療成為綜合治療的重要組成部分。5?Fu現(xiàn)為結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)化療的基礎(chǔ)，因有較多的毒副作用而受到限制。近年逐漸推出較少毒副作用、無(wú)直接細(xì)胞毒性的 5?FU 前體藥物如 5′?DFUR、卡培他濱等。5?FU前體藥物之所以無(wú)細(xì)胞毒性，與胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）有很大的關(guān)系。TP是5?FU前體類藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，其催化得到終產(chǎn)物5?FU從而發(fā)揮抗腫瘤作用。高TP表達(dá)能增強(qiáng)患者對(duì)5?FU前體藥物化療的敏感性，提高化療效果，從而改善腫瘤患者的預(yù)后［4］。張繼民等［5］用ELISA法對(duì)LS174T、LOVO等6株結(jié)直腸癌細(xì)胞株進(jìn)行TP蛋白水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LS174T細(xì)胞檢測(cè)出少量的TP蛋白（0.5 Unit/mg），遠(yuǎn)高于其他結(jié)直腸癌細(xì)胞株。本研究利用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明VES+5′?DFUR組（55.50±0.95）的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力比VES+5?FU組（35.93±2.78）強(qiáng)，出現(xiàn)這種結(jié)果與LS174T細(xì)胞存在少量TP蛋白有直接關(guān)系。存在于LS174T細(xì)胞中的少量TP在細(xì)胞內(nèi)將無(wú)細(xì)胞毒性5′?DFUR轉(zhuǎn)化為5?FU，比直接使用具有毒性的5?FU的抗腫瘤效果更好。

VES作為維生素E的衍生物，對(duì)腫瘤細(xì)胞有顯著的凋亡殺傷作用，并且對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性反應(yīng)［3］。前期研究表明，VES可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞［6］、肺癌細(xì)胞［7］、乳腺癌細(xì)胞［8］、食管癌細(xì)胞（Ec109）［9］的凋亡。bcl?2 家族蛋白在程序性細(xì)胞死亡中起著關(guān)鍵性作用，通常定位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及外核膜上。線粒體途徑被bcl?2家族成員控制，它是凋亡的監(jiān)管中心，通過(guò)上調(diào)或下調(diào)bcl?2家族表達(dá)，以及通過(guò)其將信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，從而控制細(xì)胞凋亡。bcl?2家族目前至少有25個(gè)成員，根據(jù)其功能分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白［10］。bcl?2 蛋白是 bcl?2 家族中抗凋亡蛋白的代表，而bax和bid則是促細(xì)胞凋亡蛋白的代表。bcl?2蛋白可與bax蛋白形成異源二聚體，阻斷bcl?2抑制凋亡的功能，bax表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡增加，反之則細(xì)胞存活，bcl?2/bax的相對(duì)比率是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素［11］。bid蛋白是bcl?2家族的促凋亡蛋白，可被Caspase 8酶切成具有活性的bid蛋白，進(jìn)一步作用于線粒體，導(dǎo)致線粒體中的Cyt C釋放到胞漿中；bid蛋白與bax蛋白起協(xié)同作用，引起bax蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，使其與線粒體緊密結(jié)合，從而引起線粒體損傷［12-13］。本研究利用MTT法檢測(cè)觀察細(xì)胞增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與VES組相比，VES與5?FU、5′?DFUR聯(lián)合作用時(shí)能夠抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，特別是VES+5′?DFUR組的聯(lián)合作用效果尤為顯著，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot與細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，與VES組相比，人結(jié)腸癌細(xì)胞在VES與5?FU、5′?DFUR的聯(lián)合作用下，促凋亡蛋白bid、bax表達(dá)增強(qiáng)，抗凋亡蛋白bcl?2表達(dá)降低，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力增強(qiáng)。其中VES+5′?DFUR組的凋亡率（55.50±0.95）%高于VES+5?FU組（35.93±2.78）%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，VES+5′?DFUR組的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力最強(qiáng)，其促進(jìn)人結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞凋亡的機(jī)制與bid、bax蛋白的上調(diào)、bcl?2蛋白的下調(diào)有關(guān)。然而，VES與5?FU、5′?DFUR的聯(lián)合作用是通過(guò)何種機(jī)制改變bid、bax、bcl?2蛋白的表達(dá)，仍需進(jìn)一步探討。隨著對(duì)VES的深入研究，其有望成為5′?DFUR化療藥物發(fā)揮療效的增敏劑，從而為臨床化療提供一個(gè)既能保證對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，又能減少化療藥物用量的方案。