肝內膽管癌TRIM44、基質金屬蛋白酶9蛋白的表達及臨床意義

彭 睿，黃曉勇，蔡加彬，柯愛武，施國明，柏斗勝,3*

1.中南大學湘雅二醫(yī)院，長沙 410000 2.復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032 3.江蘇省蘇北人民醫(yī)院，揚州 225001

肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是一種起源于膽管上皮細胞的腫瘤，在原發(fā)性肝臟腫瘤發(fā)病率中排名第二[1]。近年來，我國ICC發(fā)病率逐年升高，由于ICC起病隱匿，侵襲轉移能力強，且缺乏有效的早期診斷標志物，除早期手術外其他治療效果有限，患者中位生存期時間短且易轉移復發(fā)[2-3]。因此，探討ICC復發(fā)及轉移過程中的分子機制，篩查新的關鍵分子，對于ICC腫瘤治療及預后改善有重要臨床意義。

TRIM44是Triple motif(TRIM)三基序蛋白家族成員之一，該家族成員結構各異、功能不同，但主要為E3泛素連接酶[4]。TRIM家族成員功能涉及細胞分化、細胞增殖、細胞免疫等[5-6]。研究表明：TRIM44在肺癌[7]、前列腺癌[8]、甲狀腺癌[9]、食管癌[10]、肝癌[11]中高表達且表現(xiàn)為促癌作用，但是在ICC中的表達及臨床意義不明。

基質金屬蛋白酶9(MMP9)是基質金屬蛋白酶家族成員之一，又稱為明膠酶B，其大多數(shù)時候是無活性的前體蛋白，在細胞外蛋白酶修飾后才被活化。其作用主要是降解Ⅳ型、Ⅴ型膠原蛋白[12]，參與許多生理過程，如胚胎發(fā)育、組織分化等，也與諸多疾病密切相關，包括炎癥和腫瘤[13]。在腫瘤中，MMP9降解基底膜和細胞外的Ⅳ型、Ⅴ型膠原蛋白，直接導致腫瘤細胞突破基底膜，促進腫瘤細胞侵襲、轉移[14]，并且在肝癌和胰腺癌中可作為預后指標[15]。我們的前期研究[16]發(fā)現(xiàn)TRIM44可通過ERK1/2信號途徑促進ICC細胞的侵襲轉移。而ERK1/2信號在MMP9表達中發(fā)揮重要作用[17-18]。因此，本研究擬探討TRIM44和MMP9在ICC中的表達及其相關性，并分析兩者在ICC患者預后中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 組織來源及患者資料 2002～2009年復旦大學附屬中山醫(yī)院收治的87例ICC患者腫瘤及癌旁組織入選本研究。所有患者都進行了完整的手術切除，并有明確的病理診斷和5年隨訪資料。本研究獲得了復旦大學附屬中山醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。所有患者均知情同意。

1.2 免疫組織化學染色測定蛋白表達 87例患者的腫瘤組織芯片由上海芯超公司制作，取芯片60℃高溫烘烤1 h，二甲苯脫蠟2次，每次10 min，分別用95%、85%、75%無水乙醇梯度水化，每步驟5 min，然后用PBS清洗，切片滴加3%過氧化氫孵育30 min；之后將芯片放入煮沸的EDTA(pH=8.0)的抗原修復液中20 min，然后用5%的胎牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，分別滴加一抗TRIM44(Proteintech，11511-1-AP，1∶400)，MMP9(Abcam，ab76003，1∶2 000)，4℃孵育12 h；第2天洗去一抗并使用屬兔通用二抗室溫孵育1 h，DAB顯色；鏡檢觀察至深棕色不變后放入清水終止反應，蘇木精染核1 min，1%鹽酸乙醇分色，反藍；最后無水乙醇脫水，二甲苯透明風干，中性樹膠封片拍照。TRIM44和MMP9陽性評分標準參照文獻[16,19-20]。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0軟件，組間資料用χ2檢驗，Kaplan-Meier法分析生存曲線，單因素和多因素分析采用Cox風險回歸模型，檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 ICC腫瘤及癌旁組織TRIM44、MMP9蛋白的表達 結果表明：TRIM44蛋白主要表達于細胞質(圖1A)，TRIM44在ICC腫瘤中表達水平較癌旁組織更高(P<0.05)，且TRIM44在癌組織中表達異質性明顯；MMP9蛋白主要表達于細胞質，在間質中少量表達(圖1B)，癌組織明顯高于癌旁組織(P<0.05)，且在不同癌組織中表達差異明顯。

圖1 ICC及癌旁組織TRIM44、MMP9蛋白的表達

A：TRIM44在ICC組織中的表達；B：MMP9在ICC組織中的表達.Original magnification：×40(原圖)，×200(放大)

2.2 ICC組織TRIM44、MMP9蛋白表達的相關性 結果(圖2)表明：ICC組織TRIM44、MMP9蛋白表達存在異質性；87例患者ICC組織中TRIM44、MMP9蛋白表達的陽性強度正相關(r2=0.412 6，P<0.001)。

圖2 ICC 組織TRIM44、MMP9蛋白表達的相關性

2.3 ICC組織TRIM44、MMP9蛋白表達與患者預后的關系 結果顯示：TRIM44表達高的ICC患者(n=36)生存率明顯低于TRIM44低表達患者(n=51)，復發(fā)率則高于低表達組(圖3A、3B，P=0.017、P=0.001)。與此同時，MMP9表達高的患者(n=40)生存率更低，復發(fā)率更高(圖3C、3D，P<0.001)。將兩個指標合并分析(圖3E、3F，P<0.001)，將患者分為3組，第1組為兩者均高表達組(n=19)，第2組為兩者均低表達組(n=30)，剩余為第3組(n=38)。結果顯示兩者均低表達組的總體生存率高于其他兩組(P<0.001)，而第3組和第1組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.099)。在累計復發(fā)率方面，兩者均低表達組患者的復發(fā)率明顯低于其余兩組(P<0.001)，兩者均高表達組的復發(fā)率較第3組更高(P=0.026)。

圖3 ICC組織TRIM44、MMP9蛋白表達與患者預后的相關性分析

A：TRIM44表達與ICC患者總體生存率的關系，高表達組患者預后差(P=0.017)；B：TRIM44表達與ICC患者術后復發(fā)的關系，高表達組患者復發(fā)率高(P=0.001)；C：MMP9高表達的患者生存率更低(P<0.001)；D：MMP9高表達患者復發(fā)率更高(P<0.001)；E：兩者均低表達患者生存率更高；F：兩者均高表達患者復發(fā)率更高

2.4 TRIM44、MMP-9表達與ICC患者臨床病理因素相關性分析 結果(表1)表明：TRIM44表達高低與淋巴結轉移密切相關(P=0.014)，MMP9的表達與腫瘤大小(P=0.007)、AFP水平(P=0.02)、淋巴結轉移密切相關(P=0.012)。

2.5 ICC患者預后影響因素分析 結果(表2)表明：腫瘤大小(直徑<5 cmvs≥ 5 cm)、腫瘤個數(shù)(單個vs多個)、淋巴結轉移(無vs有)、癌栓(無vs有)、肝硬化(無vs有)、腫瘤分化(低vs高)、TRIM44表達(低vs高)、MMP9表達(低vs高)、兩者共同表達(1組vs2組和3組)是影響ICC患者總體生存率和復發(fā)率的因素。多因素分析結果顯示TRIM44蛋白表達、MMP9蛋白表達及兩者共同表達是影響ICC患者累計復發(fā)率的獨立預后因素。

表1 TRIM44、MMP9蛋白表達與ICC患者臨床病理因素相關性分析

aFisher精確檢驗；AFP：甲胎蛋白；HBsAg：乙肝表面抗原；CA19-9：糖類抗原19-9.*P<0.05

3 討 論

近年來ICC的發(fā)病率日漸升高，由于該腫瘤異質性強，早期診斷困難，手術外有效的治療手段較少。針對ICC的診斷和治療研究一直是臨床上的熱點[21-22]。本研究探討TRIM44和MMP9蛋白在ICC腫瘤中的表達情況，發(fā)現(xiàn)TRIM44和MMP9在腫瘤組織的表達普遍高于其對應的癌旁組織，并且兩者表達正相關，進一步研究結果顯示兩者高表達均與患者的淋巴結轉移密切相關。TRIM44和MMP9同時高表達的患者生存率更低，復發(fā)率更高，兩者共同低表達的患者生存率較高，總體復發(fā)率更低，并且為獨立的復發(fā)因素。

TRIM44作為TRIM家族成員，是一種特殊的泛素化酶，涉及多種病理生理過程[23]。既往研究顯示TRIM44在腫瘤常呈過表達情況，并且可通過AKT-NF-κB信號通路促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[7,11,24]。我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)TRIM44也可以影響ERK1/2信號通路[16]。另外我們前期報道UHRF2在ICC中的表達及作用，盡管該分子也能作為潛在的ICC診斷標志物，但本研究考慮MMP9和腫瘤侵襲轉移密切相關，而前期研究也認為TRIM44和腫瘤侵襲轉移有關。因此，本研究進一步分析了TRIM44、MMP9表達的相關性，結果顯示TRIM44和MMP9表達正相關。結果提示TRIM44可能和MMP9表達有著密切關系，未來研究擬在TRIM44干擾和過表達的細胞株內驗證MMP9的表達水平，并且通過免疫共沉淀法檢測兩者是否有直接相互作用關系。

綜上所述，TRIM44和MMP9在ICC腫瘤中的表達上調顯示其與ICC腫瘤發(fā)展密切相關，聯(lián)合兩者表達情況可為ICC患者復發(fā)和預后評估提供參考。