活化轉(zhuǎn)錄因子3對(duì)綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠肺組織核因子-κB表達(dá)的影響

吳秀琳 李明霞 錢斕蘭 郭亮 吳學(xué)玲

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome, ALI/ARDS)是由各種致病因素直接或間接損傷導(dǎo)致彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，最終因炎癥反應(yīng)失控而發(fā)生急性呼吸困難、低氧血癥和非心源性肺水腫的臨床危重癥，為常見的進(jìn)展迅速的炎癥性肺疾病，是膿毒血癥、爆發(fā)性流感、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、重癥肺炎等疾病的主要死亡原因[1-2]。近年來(lái)，雖然ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制和臨床治療研究已取得了很大的進(jìn)展，然而其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚無(wú)有效的治療方案，其發(fā)病率及病死率高居不下，病死率仍高達(dá)40%左右[3-4]。因此對(duì)ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制及其防治的研究就具有重要的臨床意義。

近年來(lái)研究證實(shí)，ALI/ARDS本質(zhì)是炎癥反應(yīng)失控，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。其中，細(xì)菌感染是引發(fā)ALI的常見病因，綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是院內(nèi)感染最常見的致病菌之一。內(nèi)毒素(LPS，革蘭氏陰性菌外膜的主要成分)可與脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein, LBP)不同位點(diǎn)結(jié)合后形成LPS/LBP/mCD4復(fù)合物，發(fā)揮致炎或抗炎雙重生物學(xué)效應(yīng)[5-8]。LPS的類脂A與LBP的致炎位點(diǎn)結(jié)合，經(jīng)CD14和TLR4信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，可使NF-κB激活移位入核向胞內(nèi)傳遞信號(hào)，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致炎癥過(guò)度表達(dá)，發(fā)揮其致炎作用；LPS的類脂A與LBP的抗炎位點(diǎn)結(jié)合，則促進(jìn)LPS與HDL結(jié)合，對(duì)“持續(xù)的過(guò)激的炎癥反應(yīng)”起到滅火作用[9]。活化轉(zhuǎn)錄因子3(activated translating factor 3, ATF3)即是近年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)炎癥調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)其與“高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)”結(jié)合是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵[10]。在非感染性疾病，如呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)，ATF3亦可通過(guò)降低炎癥反應(yīng)對(duì)肺損傷有保護(hù)作用，說(shuō)明ATF3對(duì)炎癥反應(yīng)可能有“剎車”作用[11]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)ATF3對(duì)綠膿桿菌所致急性肺損傷小鼠的炎癥反應(yīng)有抑制作用，表明其對(duì)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路有負(fù)性調(diào)控作用[12]。因此本研究繼續(xù)采用綠膿桿菌所致急性肺損傷模型，探討ATF3對(duì)綠膿桿菌所致急性肺損傷小鼠肺組織NF-κB表達(dá)的影響，為ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，并提供可能的新的治療靶點(diǎn)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

熒光標(biāo)記的綠膿桿菌，系復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院呼吸科宋元林教授贈(zèng)送。C57BL/6(17.8～26.25 g)小鼠，SPF級(jí)，系于陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買。ATF3敲基因小鼠(18.9～24.91 g)，系經(jīng)美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)Tsonwin Hai教授同意，由武漢大學(xué)模式動(dòng)物協(xié)同創(chuàng)新中心李紅良教授贈(zèng)送，于陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))新橋醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)。小鼠適應(yīng)3～4 d，隨機(jī)將小鼠分為4組，分別為野生型小鼠對(duì)照組(WC組，即予野生型小鼠滴入生理鹽水)、野生型小鼠急性肺損傷組(WA組，即予野生型小鼠滴入綠膿桿菌)統(tǒng)稱WT小鼠、ATF3-KO敲基因小鼠對(duì)照組(KC組，即予敲基因小鼠滴入生理鹽水)、ATF3-KO敲基因急性肺損傷組(KA組，即予敲基因小鼠滴入綠膿桿菌)，統(tǒng)稱ATF3-KO小鼠。PA滴入后分別于0、3、6、12及24 h(每個(gè)時(shí)相點(diǎn)5只小鼠)處理小鼠。

二、研究方法

1. 急性肺損傷小鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)： ①綠膿桿菌菌液的配制：從-80 ℃冰箱取出并解凍原始菌種，并接種于哥倫比亞血平板，普通三區(qū)劃線后放入37 ℃孵箱中，24 h后可長(zhǎng)出大量菌落。用接種環(huán)取適量1～2個(gè)菌落，置于無(wú)菌生理鹽水中，用DL-ZD1濁度計(jì)調(diào)至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，相?dāng)于1.5×108cfu/ml(引自衛(wèi)生部規(guī)范教材《微生物學(xué)和微生物檢驗(yàn)》第二版)；②小鼠置于秤盤中稱重；③麻醉小鼠：將乙醚瓶口小心打開后，取醫(yī)用棉球一朵用乙醚沾濕，置于密閉的燒瓶?jī)?nèi)，隨之小鼠置入燒瓶?jī)?nèi)約1 min，見小鼠被乙醚麻醉后立即取出小鼠，進(jìn)行后續(xù)滴鼻操作。乙醚麻醉過(guò)程中需注意掌握時(shí)間，若麻醉時(shí)間過(guò)短則在后續(xù)操作過(guò)程中小鼠易醒影響操作，若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則小鼠容易死亡；④綠膿桿菌或生理鹽水滴鼻：乙醚麻醉滿意后，用左手提起小鼠頭頸部皮膚，頭部垂直向上，右手用10 μl移液器將綠膿桿菌菌液(1.5×108cfu/ml的濃度)或生理鹽水共50 μl經(jīng)鼻滴入肺內(nèi)，滴注過(guò)程中可見小鼠鼻孔處有氣泡產(chǎn)生，但嘴內(nèi)無(wú)液體流出，表明綠膿桿菌經(jīng)過(guò)呼吸道到達(dá)小鼠肺內(nèi)；⑤全身麻醉小鼠：實(shí)驗(yàn)設(shè)置時(shí)間點(diǎn)后，分別在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行全身麻醉，用左手拇指和食指抓住頸部皮膚，固定并提起小鼠頭部，小指夾住尾巴，用戊巴比妥250 mg/kg以45 ℃方向進(jìn)針進(jìn)行腹腔注射麻醉小鼠。小鼠皮膚較薄，在注射時(shí)注意觀察藥物是否外漏；⑥肺泡灌洗：待麻醉成功后，將小鼠固定于操作板上，解剖頸部以暴露氣管，于氣管上端剪一小口，置入氣管導(dǎo)管，用生理鹽水1 ml反復(fù)灌洗3次，留取約0.7～0.8 ml左右灌洗液于EP管中，做好標(biāo)記，放置于冰箱(-80 ℃)備用；⑦收集肺組織標(biāo)本：將小鼠固定于操作板上，打開胸腔，暴露肺組織，小心取下肺組織，部分肺組織行石蠟包埋、切片及HE染色，部分用于提取蛋白。

2. 小鼠肺組織病理學(xué)檢查： 小鼠處理及實(shí)驗(yàn)分組同前。(1)肺組織石蠟包埋及切片：酒精脫水：將肺組織從4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)中取出進(jìn)行梯度酒精脫水：75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇分別脫水30 min，100%乙醇脫水兩次，每次30 min；脫水透明：將肺組織置于透明劑二甲苯中進(jìn)行透明兩次，每次30 min，以脫出組織中酒精;浸蠟與包埋：將已透明的肺組織置于已溶化的石蠟中，隨之放入60 ℃烤箱中。待肺組織完全浸于石蠟后，用石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋。放置于4 ℃冰箱過(guò)夜，待冷卻凝固成塊；切片：將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，用切片機(jī)切成薄片，切片厚度約為5 μm；(2)HE染色：將切下的薄片貼到載玻片上，置于45 ℃恒溫箱中烘干；脫蠟：染色前使用二甲苯脫蠟2次，每次10 min；由高到低濃度酒精梯度水化：分別于100%酒精，100%酒精，95%酒精，95%酒精水化各10 min，最后用ddH2O沖洗；蘇木素水溶液中染色3 min，用ddH2O沖洗3 min；用0.5%鹽酸酒精分色20 s，ddH2O沖洗1 min；用0.5%伊紅染色3 min，ddH2O沖洗2 min；60 ℃恒溫箱中將切片烘干，過(guò)夜；經(jīng)純酒精脫水、二甲苯透明后的切片，滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片封片，顯微鏡觀察切片。

肺損傷評(píng)分按照以下三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行: ①肺泡和間質(zhì)水腫；②肺泡出血；③中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集。每項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)又分四個(gè)等級(jí)：0=正常，1=輕度變化，2=中度變化，3=重度變化。最終的肺損傷得分為：三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分的總和(總分為9)。

3. Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠肺組織中ATF3的表達(dá)，以及檢測(cè)WT小鼠和ATF3-KO小鼠分別吸入生理鹽水、綠膿桿菌后6h 時(shí)肺組織P-P65、P-65、IKB-α表達(dá)的變化。

①提取總蛋白；②制膠；③上樣；④蛋白電泳；⑤切膠；⑥轉(zhuǎn)膜；⑦雜交(蛋白印跡)：濕轉(zhuǎn)后，取出PVDF膜，做好標(biāo)記，進(jìn)行Western blot；⑧封閉：電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將PVDF膜放入裝有5%BSA的盤內(nèi)進(jìn)行室溫下封閉，搖床上進(jìn)行1 h；⑨孵育一抗；⑩孵育二抗；洗膜；顯影：配制ECL發(fā)光液，取100 μl ECL顯色液A液與等體積B液混勻，然后滴加至PVDF膜上，并把顯色液在膜上鋪勻，用凝膠成像儀進(jìn)行曝光顯影，并保存圖像。結(jié)果統(tǒng)計(jì)：用Photoshop軟件分析圖像，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，用Quantity One對(duì)圖像進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，組間的兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、肺組織病理變化

肺組織切片HE染色結(jié)果顯示：在WT小鼠(WC組)及ATF3-KO小鼠(KC組)吸入生理鹽水后，兩組小鼠肺組織病理變化不明顯：肺泡間隔增厚不明顯，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)亦不明顯，無(wú)肺泡出血。WT小鼠(WA組)及ATF3-KO小鼠(KA組)在吸入綠膿桿菌后6 h后，肺組織出現(xiàn)典型急性肺損傷病理變化，表現(xiàn)為：中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡出血、肺間質(zhì)水腫。按照實(shí)驗(yàn)方法部分的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺組織損傷病理評(píng)分，結(jié)果顯示KA組的得分要高于WA組，提示吸入綠膿桿菌后ATF3-KO小鼠(KA組)肺組織病變程度較WT小鼠(WA組)明顯重。

二、WT小鼠吸入生理鹽水及綠膿桿菌后時(shí)間梯度其肺組織ATF3蛋白量的表達(dá)

為了明確ATF3對(duì)于綠膿桿菌誘導(dǎo)的肺損傷中的作用機(jī)制，我們采用了Western biot的方法檢測(cè)了ATF3在小鼠肺組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，WT小鼠(WC組)吸入生理鹽水后肺組織中ATF3各時(shí)相點(diǎn)表達(dá)與空白組無(wú)明顯差異(P>0.05)；WT小鼠(WA組)吸入綠膿桿菌后肺組織中ATF3分別于3 h及24 h處高峰，其中24 h峰值高于3 h峰值，均較空白組存在顯著差異(P<0.05)，見圖1。

圖1 WT小鼠吸入生理鹽水及綠膿桿菌后時(shí)間梯度其肺組織ATF3蛋白量的表達(dá)(a,b,c,d，P<0.05)

三、WT小鼠及ATF3-KO小鼠分別吸入生理鹽水、綠膿桿菌后6 h 時(shí)P-P65、P-65、IKB-α表達(dá)

為明確ATF3對(duì)綠膿桿菌誘導(dǎo)的ALI中肺組織NF-κB表達(dá)的影響，采用了Western biot的方法檢測(cè)取6h時(shí)相點(diǎn)對(duì)比P65、P-P65、IKB-α的蛋白表達(dá)。ATF3-KO小鼠(KA組)吸入綠膿桿菌6 h后P-P65、IKB-α表達(dá)顯著高于KC組及WA組、WC組，存在顯著差異(P<0.05)。結(jié)果顯示，吸入綠膿桿菌后ATF3-KO小鼠NF-κB活性表達(dá)明顯增加，見圖2。

討 論

ALI/ARDS是由于各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的以嚴(yán)重呼吸困難和頑固性低氧血癥和非心源性肺水腫為特征的機(jī)體炎癥失控性急性臨床綜合征[1-2]。重度細(xì)菌感染造成的膿毒血癥是ALI最常見死亡原因之一，而綠膿桿菌是導(dǎo)致膿毒血癥中最主要的革蘭氏陰性桿菌細(xì)菌，其細(xì)菌內(nèi)毒素的活性成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)則是ALI首位危險(xiǎn)因素[13]。雖然通過(guò)有效抗生素及機(jī)械通氣等手段治療，但療效欠佳，病死率仍高。ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，其中TLR信號(hào)通路的過(guò)度激活可能是其發(fā)病機(jī)制之一，因此尋找新的針對(duì)TLR信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控因子非常必要。

通過(guò)借助基因組分析和生物信息學(xué)手段，從大量調(diào)控基因中篩選出的一個(gè)具有負(fù)性調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因就是ATF3，其是一個(gè)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)下的快反應(yīng)基因，在炎癥信號(hào)通路中具有重要調(diào)控作用。根據(jù)既往研究報(bào)道及本研究前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ATF3敲基因小鼠巨噬細(xì)胞可釋放大量多種炎癥因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α)，明顯高于WT小鼠及KC對(duì)照組，提示LPS與TLR4結(jié)合時(shí)會(huì)誘導(dǎo)ATF3的表達(dá)，故推測(cè)ATF3對(duì)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路有負(fù)性調(diào)控作用[12,14-16]。據(jù)最新的研究表明，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的ATF3可抑制中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的遷移，亦提示ATF3是TLR4信號(hào)通路中的重要的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，其作用的發(fā)揮可能是通過(guò)Tiam2途徑[17]。在小鼠巨噬細(xì)胞中，ATF3能抑制趨化因子CCL4的表達(dá)和分泌，控制過(guò)度的炎癥反應(yīng)[18]。ATF3可抗衡環(huán)切力(CS)和高通氣帶來(lái)的炎癥反應(yīng)，提示其對(duì)VILI亦有保護(hù)作用[11]。上述結(jié)果及很多文獻(xiàn)均提示ATF3可降低炎癥反應(yīng)，對(duì)炎癥反應(yīng)有“剎車”作用，是TLR4信號(hào)通路中重要的負(fù)性調(diào)控基因[14，19]?；谖墨I(xiàn)報(bào)道和前期研究結(jié)果，我們有理由相信上調(diào)ATF3的表達(dá)對(duì)急性肺損傷小鼠有保護(hù)作用，且推測(cè)ATF3可能通過(guò)負(fù)性調(diào)控炎癥損傷而參與調(diào)節(jié)ALI的發(fā)生發(fā)展。

圖2 WT小鼠及ATF3-KO小鼠分別吸入生理鹽水、綠膿桿菌后6 h時(shí)P-P65、P-65、IKB-α表達(dá)對(duì)比(a,b,c,P<0.05)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吸入PA后肺組織炎癥病理改變明顯，說(shuō)明本研究中采用吸入綠膿桿菌懸液誘導(dǎo)建立的內(nèi)毒素性ALI模型是成功的。本研究的前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予LPS腹腔注射后，ATF3 mRNA及蛋白表達(dá)高峰水平在2 h時(shí)相點(diǎn)，且6 h、12 h、24 h時(shí)相點(diǎn)表達(dá)水平仍是高于正常水平的。本試驗(yàn)中WT小鼠吸入生理鹽水及綠膿桿菌均能誘導(dǎo)ATF3蛋白表達(dá)明顯增加，其中生理鹽水組在3 h時(shí)相點(diǎn)達(dá)最高峰，綠膿桿菌組在3 h、24 h時(shí)相點(diǎn)達(dá)最高峰，其中24 h較3 h峰值還高，均較空白組存在顯著差異，上述研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[15，20-22]。再次證實(shí)了ATF3在應(yīng)激信號(hào)出現(xiàn)后其mRNA水平能迅速提高這一現(xiàn)象，存在ATF3表達(dá)上調(diào)的適應(yīng)性反應(yīng)[23-27]。前期研究亦提示ATF3在綠膿桿菌誘導(dǎo)的ALI小鼠肺泡灌洗液中能夠抑制炎癥因子的表達(dá)，均證實(shí)了上調(diào)ATF3能負(fù)性調(diào)控綠膿桿菌誘導(dǎo)的ALI的肺組織炎癥損傷[12]。

以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ATF3對(duì)ALI有保護(hù)作用，而ATF3對(duì)ALI的保護(hù)作用則應(yīng)歸因于其對(duì)TLR4信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用。ATF3誘導(dǎo)機(jī)制較復(fù)雜，涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。而氧化應(yīng)激和TLR4信號(hào)通路是急性肺損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵途徑[28]。Nguyen等[29]研究證實(shí)，ATF3被誘導(dǎo)而表達(dá)上調(diào)是通過(guò)TLR4下游的JNK/c-jun信號(hào)通路。為了進(jìn)一步探討ATF3對(duì)于綠膿桿菌誘導(dǎo)的ALI的作用機(jī)制，我們采用了Western biot的方法檢測(cè)了NF-κB在小鼠肺組織中的活性表達(dá)。本文結(jié)果顯示，吸入綠膿桿菌后ATF3-KO小鼠NF-κB的活性表達(dá)明顯增加，且在6 h時(shí)相點(diǎn)達(dá)高峰，與既往報(bào)道相一致[15，21]。本文上述結(jié)果提示在綠膿桿菌誘導(dǎo)所致ALI中，ATF3負(fù)性調(diào)控炎癥反應(yīng)可能是通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路所完成。鑒于以上結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，提示TLR4/NF-κB信號(hào)通路可能是ATF3調(diào)控ALI肺部炎癥損傷的途徑之一[30]。

綜上所述，前期研究證實(shí)了ATF3對(duì)綠膿桿菌所致ALI小鼠有保護(hù)作用，即對(duì)過(guò)激炎癥反應(yīng)有負(fù)性調(diào)控作用，而本研究則證實(shí)其作用機(jī)制可能是ATF3作用于巨噬細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通道，從而發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。這些結(jié)果提示上調(diào)ATF3的表達(dá)有望成為治療ALI的潛在靶點(diǎn)。

致謝：感謝復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院呼吸科宋元林教授贈(zèng)送的熒光標(biāo)記的綠膿桿菌，感謝武漢大學(xué)李紅良教授贈(zèng)送的ATF3敲基因小鼠。