基于Image J軟件的裸鼠肝臟原位腫瘤圖像定量分析方法

姜棋予，陳艷，李瑞生，孫慧偉，李曉娟，柴燕濤，王志杰，楊銳創(chuàng)，張瑩石，馮帆，侯俊

解放軍第三〇二醫(yī)院 臨床研究管理中心，北京 100039

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等在我國有很高的感染率，隨著時間的推移以及疾病的逐漸進展，這些患者有很大的風險最終罹患肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），這使得肝細胞癌不僅嚴重危害我國人民健康，也是現(xiàn)階段公共衛(wèi)生事業(yè)的重大挑戰(zhàn)[1]。目前，進展期肝細胞癌的藥物治療面臨巨大挑戰(zhàn)，這集中體現(xiàn)在：①進展期肝細胞癌對各種傳統(tǒng)化療藥物均極不敏感[2]；②現(xiàn)有治療策略是各種口服分子靶向藥物，但這些藥物價格昂貴，療效在患者個體間的差異也很大[3]。因此，進展期肝細胞癌分子靶向藥物的研發(fā)歷來是研究的熱點與難點。利用裸鼠等動物模型建立肝細胞癌腫瘤模型，是進展期肝細胞癌分子靶向治療相關分子腫瘤學研究、分子藥理學研究的基礎。

盡管已經取得了諸多進展，但現(xiàn)有動物研究模型仍存在諸多不足：①裸鼠皮下腫瘤盡管是一種在體（in vivo）研究模型，但惡性腫瘤細胞在裸鼠皮下的生長與其在肝臟原位的實際生長狀態(tài)有較大差異；②進展期肝細胞癌具有很強的轉移與侵襲能力，尚無可靠與直觀的在體研究模型可對此進行研究，需要建立更加直觀和行之有效的腫瘤動物模型；③分子靶向藥物相關藥理學、藥效學研究對結果的量化分析有較高要求，但現(xiàn)有研究策略更適用于定性研究，對定量研究的技術與方法儲備不足，難以對腫瘤組織、臟器等照片文件進行定量分析。為解決這些問題，我們利用高侵襲性的肝細胞癌細胞MHCC97-H，經由肝門靜脈注射接種裸鼠肝臟后形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶（nodules），利用Image J軟件對肝臟臟器照片進行定量分析，可精確測定腫瘤病灶的面積以反映腫瘤大小與臟器病變程度。在此基礎上，我們利用該技術進行了索拉非尼的藥敏實驗，獲得了索拉非尼抗腫瘤作用的定量結果（對MHCC97-H在裸鼠肝臟形成病灶的抑制率）。

1 材料與方法

1.1 材料

免疫缺陷小鼠（BALB/c品系的胸腺缺失小鼠）購自北京市斯貝福生物科技有限公司，吸入麻醉劑異氟烷購自深圳沃瑞德公司，小動物實驗相關手術器械由本實驗室保存；高侵襲性人肝細胞癌細胞系MHCC97-H為本實驗室保存，用含10%胎牛血清（Invitrogen公司產品）的DMEM培養(yǎng)液（Invitrogen公司產品）培養(yǎng)；病理實驗Masson染色試劑盒為北京中杉金橋公司產品；圖像分析軟件為Adobe Photoshop（版本號CS6 13.0×64）和Image J軟件（版本號1.51j8，由美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)布）；DMSO、吐溫80及PEG400等均為Sigma公司產品。

1.2 免疫缺陷小鼠肝臟原位腫瘤模型的建立[4]

培養(yǎng)MHCC97-H細胞，待其狀態(tài)良好后，收集細胞并計數(shù)，用注射用水（滅菌的生理鹽水）重懸，備用；雌性5～6周齡BALB/c品系免疫缺陷小鼠在潔凈空間（SPE飼養(yǎng)條件）用經60Co-γ照射除菌的飼養(yǎng)墊料和飼料進行飼養(yǎng)。用吸入麻醉劑異氟烷在麻醉機持續(xù)麻醉實驗動物（首次麻醉時異氟烷濃度為3.5%，持續(xù)麻醉時異氟烷濃度為1.5%～2.0%）。將麻醉的小鼠固定于粘鼠板上，在其腹部劍突下方剪開一個約1.5 cm的開口，輕輕擠出肝右葉后暴露肝門靜脈，用醫(yī)用注射器（滅菌注射器）在肝門靜脈中注射MHCC97-H細胞懸液，注射的總體積為 100～200 μL，細胞量為 5×105。接種完畢，將肝葉推回腹腔內進行縫合，注意縫合的層次并縫合3～4針即可。如有少量出血則進行按壓止血。

1.3 肝臟腫瘤多發(fā)與彌散病灶照片的定量分析

收集動物，獲得肝臟臟器，拍照獲得垂直視角圖片。同時收集組織標本，將其制備為石蠟切片，進行Masson染色實驗，對腫瘤病灶進行確認。在此基礎上，對拍照所得的肝臟臟器照片進行圖像定量分析：①用Photoshop軟件打開獲得的肝臟腫瘤垂直視角拍攝圖片，用軟件工具欄中的“磁性套索工具”，沿圖片中小鼠肝臟邊緣進行選取，復制所選區(qū)域粘貼于黑色背景中，保存圖片；②將①中獲得的黑色背景照片用Image J軟件打開，點擊路徑ImageColorSplit Channels，可獲得圖片的紅（R）、綠（G）、藍（B）等3個RGB象限分析結果；③由于肝臟臟器在圖片中呈現(xiàn)的主色調接近紅色，為保證腫瘤顏色與腫瘤本體顏色的色差，故選取綠色或藍色為下一步操作的圖像，本次操作以綠色為操作圖像；④點擊菜單ImageAdjustThreshold路徑，將第二排滾動條拖動至顯示數(shù)值為“255”，第一排滾動條拖動至紅色基本覆蓋腫瘤部位，可確定腫瘤部位占整個圖片的比例；⑤進一步，將第一排滾動條向左拖動，至數(shù)值顯示為“1”，可確定肝臟臟器占整個圖片的比例。

1.4 分子靶向藥物敏感性檢測實驗

對前述獲得的動物模型進行分子靶向治療，將裸鼠分為2組，即對照組（未治療組）和索拉非尼治療組（灌胃給予2 mg/kg的索拉非尼，隔日給藥）。待治療10次（飼養(yǎng)3周左右）后，收集動物獲得肝臟臟器，拍照后對圖像進行定量分析，依據(jù)對照組與索拉非尼治療組腫瘤組織占肝臟總面積的比例，計算索拉非尼作用于MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟形成腫瘤病灶的抑制率：抑制率=（未治療組腫瘤病灶面積-治療組腫瘤病灶面積）/未治療組腫瘤病灶面積。

1.5 統(tǒng)計學分析

結果顯示為x±SD，用SPSS17.0軟件，采用單因素方差分析計算P值，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 MHCC97-H細胞能夠在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶

結果如圖1所示，經由肝門靜脈注射MHCC-97H細胞，可在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶（圖1A）。在此基礎上對肝臟標本進行病理染色（Masson染色）（圖1B），能夠清晰和直觀地顯示腫瘤組織與周圍正常組織，對圖1A的結果進行了確證。

2.2 裸鼠肝臟多發(fā)與彌散腫瘤病灶的圖像定量分析

首先，用Photoshop軟件沿鼠肝臟邊緣進行選取，復制所選區(qū)域并粘貼后獲得了背景為黑色的圖片（圖2A），用Image J軟件獲得了圖片的RGB象限分析結果（圖2B、C、D）。在此基礎上，分別獲得了腫瘤組織（圖3）與肝臟臟器整體（圖4）占整個圖片面積比例。其中腫瘤組織占圖片總面積的37.34%（圖3），而肝臟臟器占圖片總面積的75.05%（圖4），因此，HCC病灶占肝臟臟器總面積的49.75%（37.34%/75.05%）。這表明，建立了基于圖像分析軟件Image J的肝臟臟器照片定量分析方法。

2.3 分子靶向藥物索拉非尼抗腫瘤作用的圖像定量分析

如前述，我們建立了對裸鼠肝臟腫瘤病灶的定量分析方法。在此基礎上將其運用于藥物索拉非尼抗腫瘤作用的圖像定量分析，結果如圖5所示，經由門靜脈注射接種MHCC97-H細胞能夠在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶，圖5A為肝臟臟器照片，索拉非尼治療能夠顯著抑制MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟中形成腫瘤病灶的能力，未治療組（對照組）5個臟器中，腫瘤病灶所占比例（即相對面積）分別為57.6%、62.2%、53.1%、49.7%和44.9%，而索拉非尼治療組MHCC97-H細胞在肝臟形成的腫瘤病灶顯著縮小，其占肝臟臟器的比例依次為14.2%、16.2%、10.6%、7.9%和23.8%。圖5B為上述定量分析結果的散點圖，圖5C為依據(jù)數(shù)據(jù)所得索拉非尼作用于MHCC97-H細胞在肝臟形成腫瘤病灶的抑制率散點圖。這表明，利用建立的圖像分析方法可輔助藥物敏感性研究，定量分析所得照片等圖像文件。

圖1 肝門靜脈注射MHCC97-H細胞后能夠形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶

圖2 肝臟照片的選定及像限分析結果

圖3 HCC腫瘤病灶的識別與總面積的定量分析

圖4 肝臟臟器總面積的識別與肝臟面積的定量分析

圖5 索拉非尼對MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟形成腫瘤病灶的抑制作用

3 討論

目前，受臨床診療技術的限制，大多數(shù)HCC患者初診即為進展期，失去了外科手術等根治性治療的機會。由于進展期肝細胞癌對射線等放射治療策略極不敏感，加之其對傳統(tǒng)化療藥物也不敏感，因此臨床診療受到極大限制，患者預后較差[5]?，F(xiàn)有治療藥物主要是索拉非尼[6]、瑞戈非尼[7]及阿帕替尼[8]等分子靶向藥物。索拉非尼已廣泛用于臨床，其藥物耐受與毒副作用已有明確報道，瑞戈非尼與阿帕替尼也于近期獲準上市。因此，對這些分子靶向藥物的研究具有重要意義。但現(xiàn)有研究模型存在諸多不足：①對于皮下腫瘤可測算其腫瘤體積進行量化分析，但對于其他腫瘤模型，如肝臟原位腫瘤模型，獲得照片等圖像信息較為容易，而對圖形信息進行定量分析較為困難；②以高內涵（high content analysis）等為代表的圖像采集與分析系統(tǒng)對于圖形文件格式等的要求較為嚴格，整個工作站價格昂貴，普及性差[9-10]。為此，本研究建立了一種基于Image J軟件的圖像定量分析方法。將MHCC97-H細胞經由肝門靜脈注射裸鼠肝臟，能夠在肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶，用Image J軟件可特異和完整地將肝臟輪廓與多發(fā)與彌散的腫瘤病灶加以識別和選定，進而確定臟器、病灶的面積，二者的比值（即病灶占臟器總面積的比例）即可量化和直觀地反映MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟形成病灶的強度。

進展期肝細胞癌具有強烈的侵襲性生長與血管侵犯等病理特征[11]，因此本研究選取了MHCC97-H細胞這一高侵襲性的肝細胞癌細胞系模擬與反映進展期肝細胞癌具有的強烈的侵襲性生長特征。我們通過肝門靜脈注射接種的方式，實現(xiàn)了MHCC97-H細胞在肝臟的血道轉移與侵襲性生長，MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟形成了多發(fā)與彌散的腫瘤病灶。與現(xiàn)有腫瘤轉移與侵襲模型相比，本研究采取的模型具有諸多優(yōu)勢：①現(xiàn)有腫瘤轉移的動物模型主要是通過尾靜脈接種腫瘤細胞，腫瘤細胞通過下腔靜脈回心后，立即經由肺動脈抵達肺部[12]。盡管能夠獲得肺部的腫瘤病灶，但肺部作為氣體交換的器官有豐富的毛細血管網，腫瘤細胞經由血液循環(huán)路徑直接和非特異地留駐與毛細血管等微循環(huán)部位，不能特異性地反映出腫瘤細胞在轉移、侵襲過程中的各項生理變化；②腫瘤細胞經由肝門靜脈進入肝臟，能夠直接實現(xiàn)腫瘤細胞在肝臟內部的留駐，模擬肝轉移。肝臟血管豐富，內部分布有大血管，而接近肝包膜處毛細血管豐富。肝臟較薄，留駐于近肝包膜處的MHCC97-H細胞隨著其侵潤性生長最終會突破肝包膜，在肝臟表面形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶；③本研究建立的腫瘤模型，不僅能夠更好地模擬腫瘤細胞在肝臟原位的轉移與侵潤性生長，也適用于肺癌肝轉移、乳腺癌肝轉移等領域的研究。綜上所述，本研究建立的方法，不僅有助于模擬肝細胞癌在肝臟原位的生長，也對相關藥學研究具有重要意義。