響應面法優(yōu)化微波預處理浮萍還原糖研究

(徐州生物工程職業(yè)技術學院,江蘇徐州,221006)

隨著世界經濟的不斷發(fā)展，人們日益增長的物質需求和逐漸枯竭的能源以及環(huán)境的惡化形成尖銳矛盾。十九大之后，習總書記提出，“綠水青山就是金山銀山”。潔凈能源的開發(fā)與利用不僅可以緩解能源危機，也是實現環(huán)境優(yōu)化的必經之路[3]。目前，在潔凈能源的研究中，生物質能源作為可再生能源深受青睞。而在生物質能源的研究中，農作物秸稈是熱點。然而農作物秸稈人們可利用的物質主要為纖維素。而纖維素與木質素等緊密相連，其結構難以破壞，因此不易被酶解，且酶解還原糖產量較少生產成本高，所以目前的秸稈綜合利用率不高[2]。浮萍是一種水面浮生植物。當氣候炎熱潮濕，其生長迅速，多見于水田、池塘等靜水水域。浮萍中淀粉含量豐富，但由于其極易吸收重金屬、有機物等組分，因此不宜食用，也不宜作飼料使用。因此，浮萍是制備燃料酒精的最佳選擇[4]。而欲制備燃料酒精，必先水解其淀粉使其成為還原糖。本文采用微波預處理，主要考察微波預處理時間、微波功率、固液比對酶解產生還原糖濃度的影響，并利用響應面法進行了工藝優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與器材

1.1.1 實驗原料與器材

浮萍(徐州三環(huán)西路高架橋附近，打撈后進行烘干處理)；淀粉酶；Sartorius電子天平；水浴鍋(星羅棋布公司)；微波爐(格力公司)；吸光光度計。

1.1.2 實驗試劑

1.1.2.1 DNS溶液的制備

稱取6.3g DNS和63mL的2mol/L的NaOH溶液，加入500mL去離子水(含有182g酒石酸鉀鈉)的溶液中，攪拌均勻，之后加入5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉，攪拌使其溶解，冷卻后加水定容至1000mL，低溫保存于棕色瓶中[1]。

1.1.2.2 葡萄糖標準溶液的制備

精密稱取干燥恒重的葡萄糖0.5g，經少量水溶解后加3mL 12mol/L的濃硫酸，以去離子水定容至1000mL，即為500mg/mL葡萄糖標準溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 還原糖濃度的測定

1.2.1.1 葡萄糖標準曲線的繪制

取6支試管，按表1的順序加入各種試劑。加入純凈水振蕩后，在540nm下檢測，以1號管為空白管，記錄吸光度A為540nm，橫坐標為吸光度，縱坐標為葡萄糖濃度，所擬合的曲線R值為0.9995，擬合度良好[1]。

1.2.1.2 還原糖濃度的測定步驟

從經過處理的浮萍中分別精密稱取(0.5±0.01)g加入對應編號試管中，用移液管移取配制好的纖維素酶溶液2.5 mL，再加入pH值4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液25mL，混合均勻。50℃下，將上述混合溶液150 r/min振蕩進行催化反應1 h后，置于沸水浴2min終止酶解反應，并濾紙過濾，之后迅速進行還原糖濃度的測定。用DNS法測定還原糖濃度(CRed)，并以此代表酶解效果[1]。

表1 葡萄糖標準曲線的測定方法

1.2.1.3 還原糖濃度的測定方法

先將試管放入沸水浴中 2 min，目的是使酶失活，接著吸取0.5 mL待測液加入試管中，加入DNS溶液1mL于沸水中水浴5 min后冷卻，再加入8 mL蒸餾水，測定其吸光度，通過對照葡萄糖標準曲線，查出還原糖含量(mg)。如果待測液濃度超過標準曲線最大吸光度，則稀釋一定倍數后再測[1]。

1.2.2 微波處理浮萍的響應面分析實驗考察

表2 響應面實驗設計中變量與編碼

1.2.2.1 微波加熱時間對微波處理的影響

在固液比1∶30，微波功率380 W時，將微波時間分別設置為2 min，4 min，6 min，8 min，10 min進行加熱，結果見圖1。

圖1 微波加熱時間對微波處理的影響

由圖1可以看出當微波功率固定為380 W時，酶解還原糖濃度最高是在6 min。微波加熱時間長短對酶解還原糖濃度都有影響。

1.2.2.2 微波功率對微波處理的影響

在固液比1∶30，微波加熱時間6 min時，將微波功率分別設置為190 W，380 W，570 W，760 W，950 W進行加熱，結果見圖2。

圖2 微波功率對微波處理的影響

由圖2可以看出，當微波加熱時間固定在6 min時，酶解還原糖濃度最高是在380 W。微波功率對酶解還原糖濃度影響較大，過高的功率會使酶解效率大大降低。

1.2.2.3 固液比對微波處理的影響

把不同固液比的浮萍固定其微波功率380 W，微波加熱時間6 min做處理，結果見圖3。

圖3 固液比對微波處理的影響

由圖3可以看出，當固定微波功率380 W，加熱時間6 min時，酶解還原糖濃度最高是在1∶30。且由圖表的變化趨勢可以得出以下結論：固液比對酶解還原糖的影響比微波加熱時間和微波加熱功率小得多。

2 微波處理浮萍的響應面分析實驗

2.1 響應面試驗設計和實驗結果

根據Box-Behnken Design(BBD)設計原則，選取微波加熱時間、固液比、微波功率3個對微波處理影響較顯著的因素,以還原糖濃度(g/mL)為響應值，得到的試驗數據詳見表3。

表3 浮萍微波處理響應面分析結果

2.2 二元多次回歸模型分析

運用Design-Expert軟件對表三的數據進行二次多元回歸擬合，最終得到二次多元回歸方程(Y為還原糖濃度)：

Y=24.41+1.15*A+0.44*B-0.37*C-3.75*AB-0.20*AC+2.500E-003*BC-2.36*A2-2.83*B2-1.09*C2。

表4 浮萍響應面分析實驗中微波處理的分析結果

圖4 微波加熱時間和微波功率對還原糖濃度的影響

圖5 微波加熱時間和固液比對還原糖濃度的影響

圖6 固液比和微波功率對還原糖濃度的影響

運用Design-Expert軟件，進行二元多次模擬，得到二元回歸方程的等高線和響應面(圖4-6).從圖4-6中可以看出，3個因素的交互作用對還原糖濃度影響顯著，F值可以判斷各個因素對還原糖濃度的影響程度，F值越大影響程度越顯著。根據表3和圖4-6可以判斷微波加熱時間與微波功率對實驗影響最大。不同的微波加熱時間得到的最高還原糖濃度所對應的微波功率也不一樣。根據本文三個因素對實驗的影響可以判斷和確定最佳實驗數據：微波加熱時間5.64 min，微波功率350W，固液比1∶30，還原糖濃度在24.76 mg/mL。比普通實驗提取還原糖的效率高了9.83%。

3 結論

本文研究了浮萍的預處理，利用響應面法對微波處理浮萍進行了工藝優(yōu)化，并找出了顯著性因素[2]。研究發(fā)現微波功率和微波加熱時間協(xié)同作用下，微波功率過高會破壞浮萍的內部結構，微波溫度過高或過低都會使酶解反應速率變慢，本實驗中微波加熱6 min，微波功率380 W時是實驗的最佳處理數據，微波處理的功率既不會破壞浮萍的結構又能極快處理干燥浮萍。適宜的溫度也能使酶解效果達到最佳。此時，還原糖濃度在24-30mg/mL之間，相比較微波處理纖維素的還原糖濃度高得多。為下一步制備燃料酒精提供基礎。