高效薄層色譜-氣相色譜-四級桿質(zhì)譜法檢測母乳中脂肪酸分布

方景泉，遲濤，孫廣梅，張釙，徐曉娟，劉芝榮

(1．國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150028；2．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室食品學(xué)院，哈爾濱150030)

0 引 言

母乳是人類為哺育后代而分泌的乳汁，是嬰兒階段營養(yǎng)最完備的食物，母乳中的脂肪酸組成和分布對嬰兒后天健康等各個方面具有重要影響[1]。母乳中的脂肪酸主要由甘油三酯、甘油磷脂和游離脂肪酸組成。測定嬰兒母乳中的脂肪酸具有重要意義，不僅可以指導(dǎo)母乳代用品的研制和開發(fā)(如中國每年約有960萬嬰兒需要補(bǔ)充母乳代用品)，而且，因為母乳中脂肪酸組成與膳食脂肪酸組成相關(guān)[2]，可以通過改善哺乳母親膳食改變母乳脂肪酸的組成，如多不飽和脂肪酸所占比例，滿足嬰兒生長發(fā)育需求。

母乳中的脂肪酸的測定已經(jīng)有很多報道，常采用有機(jī)溶劑提取、甲酯化后經(jīng)氣相色譜(gas chromatography,GC)分析[3-5]，但這種方法無法獲得脂肪酸在甘油三酯、甘油酯等酯中的分布信息。也有一些文獻(xiàn)采用高效液相色譜質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-mass chromatography,HPLC-MS)分析脂肪酸，可以獲得結(jié)構(gòu)信息，但分析成本過高，不利于大規(guī)模篩查測定。母乳樣品量較少(約為20 m L)還要測定多個參數(shù)，因此在測定脂肪酸時在保證檢出度的情況下，盡量選擇較少的樣本量，所以其他柱層析等方法也不適用。

薄層色譜(thin-layer-chromatography,TLC)是上個世紀(jì)50年代應(yīng)用較多分離極性和非極性成分的技術(shù)[6-8]，近年來，通過改善薄層色譜的制備及操作方法，形成采用高效薄層色譜(high performance thin layer chromatography,HPTLC)和二維薄層色譜(two dimention thin layer chromatography,TDTLC)分離如脂質(zhì)等極性和非極性成分的方法[9]，在樣品的前處理方面顯示出明顯的優(yōu)越性[10]。目前聯(lián)用高效薄層色譜-氣相色譜-四級桿質(zhì)譜檢測人母乳中脂肪酸的研究尚未見報道。本研究建立了定性定量分析人母乳中脂肪酸初級結(jié)構(gòu)和成分的高效薄層色譜-氣相色譜-四級桿質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，獲得了人母乳脂肪酸成分的分布和結(jié)構(gòu)信息。

1 實 驗

1.1 儀器、試劑及耗材

分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；氮吹儀(奧特賽思儀器有限公司)；紫外可見投射反射儀(上海精科實業(yè)有限公司)；7890氣相色譜配5975質(zhì)譜(美國安捷倫公司)。

37種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；甲醇和正己烷(HPLC級，F(xiàn)isher公司)；顯色劑2,7-二氯熒光素(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；GF254高效薄層色譜板(青島海洋化工廠)；13%～15%三氟化硼甲醇溶液(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；氮?dú)狻⒑?、空氣及氫?哈爾濱黎明氣體有限公司)。所用試劑除特別標(biāo)明外，均為分析純。

樣品：中國東北地區(qū)，1-12周泌乳期母乳。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：SP-2560(100 m×0.25 mm ID 0.20μm)(Sigma公司)。進(jìn)樣口溫度240℃；恒流速模式；進(jìn)樣量1μL；分流比50∶1；程序升溫：140℃(保留5m in)，5℃/m in升至180℃ (保留10 min)，2℃/m in升至210℃(保留15 min)，10℃/m in升至240℃(保留8 min)，共64 min；FID檢測器溫度250℃；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；接口溫度210℃；溶劑延遲：9.5m in。

1.3 甘油酯和甘油磷脂的分離

樣品凍藏：采集的樣品分裝成5 m L離心管內(nèi)，于-80℃冷凍保藏，在保存30 d內(nèi)解凍進(jìn)行脂肪酸分析。

脂肪提?。悍Q取試樣1.0 g至10 m L試管中，加入0.2 m L氨水，于65℃±1℃水浴鍋中放置15 min，取出輕搖，冷至室溫。在制備好的樣品中加入1 m L乙醇，混勻。加入2.0 m L乙醚，加塞振搖1 min。加入2.0m L石油醚，加塞振搖1 min，靜置、分層，有機(jī)層轉(zhuǎn)入10 m L螺口玻璃管中。再加入2.0 m L乙醚及2.0m L石油醚，加塞振搖1 min，靜置、分層，有機(jī)層轉(zhuǎn)入螺口玻璃管，加1.0m L乙醚及1.0m L石油醚再重復(fù)操作一次。合并抽提液于螺口玻璃管中，氮吹干。得濃縮物。

甘油酯分離：向上述濃縮物中加入100μL三氯甲烷，用1 m L注射器吸取點(diǎn)樣，把點(diǎn)好樣的硅膠板放入層析缸中，緩慢充入氮?dú)?0 min，然后蓋嚴(yán)層析缸。等到層析液沿硅膠板上升到頂部時，取出硅膠板。氮?dú)獗Ｗo(hù)晾干，在硅膠板上方噴灑顯色劑0.1%2,7-二氯熒光黃顯色，在紫外燈365 nm下照射下觀察。用鉛筆畫出各個條帶的范圍。上部明亮區(qū)是甘油三酯，下部明亮區(qū)是甘油二酯，中間細(xì)微明亮的地方是游離脂肪酸，最下部分為甘油一酯。

甘油磷脂分離：將上述濃縮物用1 m L三氯甲烷溶解，把溶液注入硅膠柱中，用0.5 m L三氯甲烷清洗2～3次，洗液并入硅膠柱，用10m L三氯甲烷洗脫非甘油磷脂成分，再用12 m L甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，用氮?dú)獯蹈?，得到甘油磷脂?/p>

1.4 脂肪酸甲酯化處理

在提取的母乳脂肪濃縮物中加入0.1m L焦性沒食子酸甲醇溶液。氮吹濃縮干燥，加入1m L氫氧化鉀甲醇溶液置于80℃±1℃水浴上回流5～10 min。再加入0.5 m L三氟化硼甲醇溶液，繼續(xù)回流15 min，冷卻至室溫，將磨口玻璃管中的液體移入10m L離心管中，分別用0.3 m L飽和氯化鈉溶液清洗磨口玻璃管三次，合并飽和氯化鈉溶液于10 m L離心管，加入1 m L正己烷，振搖后，以5 000 r/m in離心5 min，取上清液作為試液，供氣相色譜儀測定。

1.5 樣品儲藏穩(wěn)定性試驗

樣品采集后，投入液氮中，運(yùn)回實驗室后，將同一母乳樣品分成30份分別儲藏在-20℃和-80℃冰箱內(nèi)進(jìn)行儲藏時間試驗，每隔6 d取樣一次。外標(biāo)法測定總脂肪中多不飽和脂肪酸DHA(docosahexaenoic acid,DHA)、花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，直至數(shù)據(jù)具有顯著性差異，為最長保存時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品儲藏及取樣量

母乳樣品的儲藏方式直接決定樣品中脂肪及脂肪酸的穩(wěn)定性，本研究通過比較DHA、ARA脂肪酸在儲存期間質(zhì)量濃度的變化，對質(zhì)量濃度按照時間順序進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果表明，儲藏在-20℃的樣品，測定到第36 d時，ARA質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.39%顯著性減少至0.34%；DHA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.37%顯著性減少至0.30%。儲藏在-80℃的樣品，測定到第72 d時，ARA質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.39%顯著性減少至0.33%；DHA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.37%顯著性減少至0.31%。儲藏溫度對脂肪酸的影響結(jié)果這與Lacom ba等[11]的研究結(jié)果類似，變化范圍與Yuhas等[3]的研究結(jié)果類似。因此，短時間能夠測定的樣品儲存在-20℃冰箱中，長期保存樣品儲存在-80℃冰箱中。

因母乳樣品有限，測定時要盡量使用較少的樣品進(jìn)行檢測。每個地區(qū)隨機(jī)取12個樣品，一開始稱樣量為5.00 g，隨后不斷減少樣品稱樣質(zhì)量，以脂肪質(zhì)量百分比2.0%和檢出限2倍為最低稱樣量。最終確定最低稱樣質(zhì)量為1.06±0.16 g。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 薄層色譜分離條件優(yōu)化

TLC是將脂類在層析缸內(nèi)用展開劑把各組分在硅膠板上進(jìn)行展開，根據(jù)各組分的極性和硅膠的吸附能力各不相同，將組分在硅膠板上分離開。展開液的極性組成及硅膠板的厚度決定了甘油三酯、甘油二酯、游離脂肪酸、甘油一酯的分離程度。硅膠板選擇0.25 mm及0.35 mm兩種。0.35 mm的薄層板硅膠層太厚，樣品分離時間長，分離條帶不夠清楚。因此選用0.25 mm厚度的硅膠板作為分離板。在展開液優(yōu)化中，將乙醚的量逐漸加大，直至各條帶明顯分開。圖1顯示了展開液優(yōu)化前后的對比。展開液組成為正己烷、乙醚和冰醋酸(體積代為70∶30∶1)時，效果較好，甘油三酯、甘油二酯、游離脂肪酸、甘油一酯清晰可見且分布均勻。紫外燈波長選擇365 nm和254 m n同時照射效果較好，這與Zaim a[12]等采用的雙波長方法一致。

4.執(zhí)法人員的綜合素養(yǎng)有待提高。作為落實“誰執(zhí)法誰普法”責(zé)任制的直接責(zé)任人，執(zhí)法人員的專業(yè)素質(zhì)和法治素養(yǎng)直接決定了“誰執(zhí)法誰普法”的工作實效。落實“誰執(zhí)法誰普法”責(zé)任制，對一線的執(zhí)法人員提出了更高的要求，不僅專業(yè)要過硬，更要有良好的法治素養(yǎng)。調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，部分執(zhí)法人員專業(yè)業(yè)務(wù)過硬，但法治素養(yǎng)較弱，運(yùn)用法治思維與法治方式解決問題的能力還不夠強(qiáng)，在面對群眾釋法說理上存在一定的短板。

本研究為增加脂肪酸的檢出率，并沒有采用通常的點(diǎn)狀點(diǎn)樣法，而是采用條形點(diǎn)樣法。將常用的尖頭點(diǎn)樣針磨平，點(diǎn)上焊錫后磨圓，形成圓形的點(diǎn)樣針頭，防止將硅膠層劃破，導(dǎo)致樣品遷移速度不一致。點(diǎn)樣時在距離薄層板短邊1.5 cm處均勻加載樣品，邊加載樣品，邊用氮?dú)獯蹈?，可反?fù)多次，直至將100μL全部加載到薄層板上。

圖1 展開液優(yōu)化前1-a和展開液優(yōu)化后1-b對比

在高效薄層色譜展開時，向展開缸內(nèi)緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)夂笊w嚴(yán)，用于保護(hù)多不飽和脂肪酸，尤其是游離脂肪酸中含有的多不飽和脂肪酸避免氧化，并使測定結(jié)果穩(wěn)定。游離脂肪酸的空間折疊結(jié)構(gòu)使雙鍵暴露在外，如不進(jìn)行氮?dú)獗Ｗo(hù)展開和晾干，很難在游離脂肪酸中測出多不飽和脂肪酸。與甘油結(jié)合的脂肪酸，雖然部分雙鍵暴露在外，但極性較小，容易溶于有機(jī)溶劑而受到保護(hù)。

2.2.2 質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍的確定

為了對人母乳中所有可能存在的脂肪酸進(jìn)行識別和檢測，采用全掃描模式進(jìn)行分析。由于有些色譜峰小且狹窄，我們采用了儀器所能提供的較高的掃描頻率。

母乳中短鏈脂肪酸特征離子從55.1開始，集中在55～150的范圍內(nèi)，中鏈脂肪酸范圍從55～250，長鏈脂肪酸從55～300，最后都有一個472的特征離子。樣品中出峰的特征離子范圍大多在55～200之間。因此質(zhì)量掃描范圍的起始值定位50。母乳中目前發(fā)現(xiàn)的脂肪酸的最大碳原子數(shù)是24，選擇500為最大質(zhì)荷比。在上述質(zhì)量掃描范圍內(nèi)，掃描速率為20 000 am u/s，掃描頻率約為35 H z。上述質(zhì)譜參數(shù)與其他研究者脂肪酸質(zhì)譜測定參數(shù)類似[13-14]，能夠滿足所有脂肪酸的定性定量分析。圖2是37種脂肪酸的質(zhì)譜圖。37種脂肪酸分離效果良好，只有一種順反異構(gòu)脂肪酸分離度為0.8，其他脂肪酸分離度均大于1。圖3是泌乳期25 d的樣品的譜圖，25 d時，母乳中脂肪酸的種類最多且達(dá)到平衡。從圖中可以看出，所有峰分離度均大于1。含量較低的月桂酸也得到檢出。

圖2 37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖

圖3 泌乳期25天樣品譜圖

37種脂肪酸特征離子見表1。使用了特征離子定性，從圖3可以看出，即使分離度稍差，也能得到很好的定性。定量時，并沒有使用所有特征離子作為定量離子，部分脂肪酸沒有獲得穩(wěn)定的定量離子，沒有獲得穩(wěn)定定量離子脂肪酸，將采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。但因為質(zhì)譜定量的局限性，對于某些需要確認(rèn)準(zhǔn)確含量的脂肪酸，采用FID檢測器精確定量。

2.3 檢出限與定量下限

分別準(zhǔn)確稱取22.2、26.0、19.0、21.0、16.0、24.0的亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸、肉豆蔻算和硬脂酸，配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照濃度由低到高的順序分別對標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)行測定，并將測得的ELSD峰面積Y與其標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，mg/L)進(jìn)行線性回歸分析，得到6種高級脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。選擇合適的最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定10次，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為測定的檢出限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為測定的定量下限。結(jié)果顯示，該方法具有線性范圍寬、檢出限低的特點(diǎn)。

表1 37種脂肪酸的特征離子

2.4 方法的精密度與回收率

選定母乳樣品，優(yōu)化條件下平行測定7次以下項目，計算回收率，測試結(jié)果和方法的精密度。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，將DHA、EPA、亞油酸、α-亞麻酸和γ亞麻酸5種脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到母乳樣品中，將加標(biāo)和未加標(biāo)的母乳樣品按照選定的樣品處理方法進(jìn)行處理后，采用優(yōu)化的方法進(jìn)行分析。根據(jù)各種高級脂肪酸在加標(biāo)和未加標(biāo)樣品中的測定量以及加入標(biāo)準(zhǔn)品的含量計算該方法的回收率，結(jié)果列于表2。從表2可知，各脂肪酸測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.9%～13.5%之間，加標(biāo)回收率在83%～104%之間，表明本方法有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確度，滿足母乳樣品中脂肪酸的定量要求。

表2 方法回收率和精密度(n=5)

2.5 樣品分析

本研究選擇東北地區(qū)36份母乳樣品進(jìn)行定性定量分析，取其中5位母親混合母乳的泌乳期7、12、25、30母乳樣品進(jìn)行總脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中的脂肪酸組成及分布的測定。表3是泌乳7天時脂肪酸的分布圖。從表中可以看出，泌乳初期，無游離脂肪酸，而且初期脂肪酸種類較少。甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中的脂肪酸與總脂肪酸并非一一對應(yīng)，可能是在總脂肪酸提取的時候，由于衍生溫度等條件、脂肪酸種類等不同，導(dǎo)致一些脂肪酸未甲酯化或未測出。甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中的脂肪酸種類大于總脂肪酸，說明本方法相比直接測定總脂肪酸，能夠獲得更為豐富的脂肪酸分布信息。

另外，甘油三酯中脂肪酸分布較廣，與總脂肪酸分布類似，這是因為母乳中脂肪95%均為甘油三酯[15]。甘油二酯中的脂肪酸主要是中長鏈脂肪酸。甘油一酯中脂肪酸是長鏈和短鏈脂肪酸，甘油磷脂中主要是中長鏈脂肪酸，其中不飽和脂肪酸所占比例較大。隨著泌乳期的變化，各甘油酯中的脂肪酸組成也不斷變化，這泌乳期內(nèi)飲食的變化直接相關(guān)，但是有一些脂肪酸發(fā)生變化很少。這些很少發(fā)生變化的脂肪酸可能對于嬰兒健康和乳汁組成具有重要作用。需要通過此測定方法進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究建立了人母乳中總脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中脂肪酸分布的高效薄層色譜-氣相色譜-質(zhì)譜分析方法。方法的主要脂肪酸的檢出限范圍為2.1～2.4 m g/L，回收率在83%～104%之間，滿足測定要求。通過該方法測定了人母乳樣品的脂肪酸相比直接測定總脂肪酸，能夠獲得更為豐富的脂肪酸分布信息。

表3 泌乳7d時脂肪酸的含量