花生種子休眠特異突變材料的創(chuàng)制及理化因素研究

胡曉輝，崔鳳高，張勝忠，苗華榮，張智猛，陳 靜

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

種子休眠性是植物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的自我保護(hù)機(jī)制，是植物界中普遍存在的特性。作物種子休眠性是一個(gè)極其重要和復(fù)雜的農(nóng)藝性狀，對(duì)農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)有著重要意義。但是很多作物在長(zhǎng)期馴化、培育過(guò)程中，注重追求高產(chǎn)高效，忽視保留適度種子休眠性，導(dǎo)致種子休眠性減弱甚至喪失，進(jìn)而引發(fā)產(chǎn)量和食用品質(zhì)下降、種用安全隱患等一系列問(wèn)題。針對(duì)種子休眠性的影響因素、遺傳機(jī)制和分子機(jī)理等研究，在水稻、小麥、玉米等均有報(bào)道[1-7]?；ㄉ?ArachishypogaeaL.)是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，年種植面積約4700 khm2，單產(chǎn)、面積、出口均居世界前列。近年來(lái)關(guān)于花生種子休眠性對(duì)我國(guó)花生生產(chǎn)的影響多有報(bào)道[8-9]，如花生收獲時(shí)期恰逢陰雨天氣導(dǎo)致花生在植株上發(fā)芽，嚴(yán)重影響產(chǎn)量、品質(zhì)和種用質(zhì)量，甚至是引發(fā)食用安全隱患，其主要根源是目前選育推廣的花生新品種休眠性較弱，所以選育具有適度休眠性的花生品種非常重要。而探索花生種子休眠機(jī)理對(duì)于培育具有適度休眠性的花生品種具有重要理論意義和指導(dǎo)作用。利用突變體研究種子休眠是一種非常有效的手段，并鑒定出許多控制種子休眠的基因[10]，包括種子成熟過(guò)程調(diào)控因子(ABI3、FUS3、LEC1、LEC2等)、激素相關(guān)調(diào)控因子(ABA代謝基因CYP707A1和CYP707A2、ABA受體ABI1、ABI2、ABI4等)、種子休眠特異基因(DEP、AtHB20、CBF、MFT、SPT等)等。應(yīng)用誘變技術(shù)育成了一些花生新品種(品系)，如早熟花生新品種魯花6號(hào)、魯花12號(hào)[11-13]。本研究以強(qiáng)休眠花生品種花育52號(hào)為試材，通過(guò)化學(xué)誘變方法，結(jié)合種子休眠性鑒定，獲得弱休眠突變材料，對(duì)比野生型和突變材料品質(zhì)、休眠及吸脹過(guò)程中理化性質(zhì)差異，以期為利用突變材料挖掘花生種子休眠的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料系花育52號(hào)[14]及通過(guò)化學(xué)誘變創(chuàng)制的突變體材料，其中花育52號(hào)為山東省花生研究所育成的花生品種。種植方式為起壟雙行單粒播種，行距40.0 cm，株距16.7 cm，每個(gè)家系種植4行，覆膜。5月上旬播種，成熟后收獲晾曬10 d直接進(jìn)行種子休眠性檢測(cè)。田間水肥管理等同于常規(guī)大田，及時(shí)進(jìn)行病蟲害防治。

花育52號(hào)通過(guò)EMS誘變獲得誘變各世代，M2和M3世代進(jìn)行單株品質(zhì)測(cè)定[15]和休眠性檢測(cè)，選擇出休眠性弱的單株；M4世代檢測(cè)株行內(nèi)所有單株品質(zhì)和3個(gè)單株的休眠性，休眠性表現(xiàn)一致的株行用于種子萌發(fā)過(guò)程中理化特性分析。

1.2 方 法

1.2.1 種子休眠性檢測(cè)

每品種設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)為：12 cm培養(yǎng)皿內(nèi)鋪2張濾紙，放置20粒成熟飽滿的花生種子，加蒸餾水于30℃條件下暗培養(yǎng)，檢測(cè)第7 d的發(fā)芽率。

以胚根和胚軸長(zhǎng)度≥種子長(zhǎng)度作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，用種子發(fā)芽率評(píng)價(jià)種子休眠性的強(qiáng)弱，發(fā)芽率高的種子休眠性弱，發(fā)芽率低的種子休眠性強(qiáng)。

1.2.2 化學(xué)誘變方法及誘變后代選擇

種子準(zhǔn)備：選用種子休眠性強(qiáng)的花育52號(hào)種子1kg，用1.5% EMS 處理后立即種植于大田獲得M0世代；后期對(duì)M2、M3、M4世代進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè)和休眠性檢測(cè)，選擇弱休眠誘變材料。

1.2.3 抗氧化酶含量和激素含量的測(cè)定

分別取無(wú)休眠突變材料HY52-100-23、HY52-100-67和休眠品種花育52號(hào)(HY52-D)的種子各150粒置于15 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，3次重復(fù)；設(shè)吸脹時(shí)間0、6、12、18、24、48 h，分別取不同吸脹時(shí)間的種子進(jìn)行主要抗氧化酶(POD和CAT)和激素含量的測(cè)定。激素包括GA和ABA。采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法，試劑盒來(lái)自臺(tái)灣生工，根據(jù)說(shuō)明書操作，利用芬蘭352型酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型與誘變后代種子休眠性和品質(zhì)

突變材料HY52-100-23和HY52-100-67的種子發(fā)芽率分別為78.33%和83.33%，野生型種子發(fā)芽率為35%；野生型材料二者間存在極顯著差異(表1)。示蹤突變材料HY52-100-23和HY52-100-67的各世代品質(zhì)的數(shù)據(jù)表明(表2)，野生型花育52號(hào)三個(gè)年份的油酸含量分別是81.59%、81.75%、81.45%，亞油酸含量分別為4.43%、3.43%、4.5%；M2、M3、M4世代，突變材料HY52-100-23和HY52-100-67的油酸含量分別為85.64%和85.64%、83.63%和80.08%、83.82%和78.94%，亞油酸含量分別為3.99%、3.02%、2.58%和3.99%、3.54%、6.91%。說(shuō)明突變材料HY52-100-23和HY52-100-67在品質(zhì)方面與野生型相比沒(méi)有明顯差異，而種子發(fā)芽率存在顯著差異。

表 1 突變材料和野生型的發(fā)芽率

表 2 突變材料和野生型的品質(zhì)

2.2 不同休眠材料吸脹萌發(fā)過(guò)程中POD和CAT變化

種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中，突變材料的POD含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖1)。突變材料與HY52同階段相比較，種子吸脹0 h、6 h時(shí)POD含量差異不顯著，12 h、18 h時(shí)POD含量差異極顯著，24 h、48 h時(shí)POD含量表現(xiàn)不同。種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中，突變材料CAT含量呈上升趨勢(shì)(圖2)。突變材料與HY52同階段比較，種子吸脹0 h、6 h時(shí)CAT含量差異不顯著，12 h、18 h、24 h、48 h時(shí)CAT含量差異顯著。

圖1 花生種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中POD變化

注：HY52：花育52號(hào)； HY52-ND：HY52-100-23和HY52-100-67。下同。

圖2花生種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中CAT變化

Fig.2 Changs in CAT during peanut seed imbibition and germination

Note: HY52: Huayu52; HY52-ND: HY52-100-23和HY52-100-67. Same as below.

2.3 不同休眠材料種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中GA和ABA變化

從圖3～5可見，隨著種子吸脹萌發(fā)，各材料內(nèi)源激素變化差異較大。HY52內(nèi)源GA含量變化幅度較小，HY52-100-23和HY52-100-67GA含量變化呈上升趨勢(shì)(圖3)各吸脹時(shí)段HY52內(nèi)源GA含量均低于HY52-100-23和HY52-100-67(0 h除外)，0 h和6 h時(shí)原種HY52與HY52-100-23、HY52-100-67內(nèi)源GA含量間差異不顯著，12 h、18 h、24 h、48 h時(shí)原種HY52與HY52-100-23和HY52-100-67GA含量間差異顯著。

種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中，HY52內(nèi)源ABA含量變幅較??； HY52-100-23和HY52-100-67的ABA含量變化呈下降趨勢(shì)(圖4)。各時(shí)段HY52內(nèi)源ABA含量高于HY52-100-23和HY52-100-67，0 h時(shí)原種HY52與HY52-100-23、HY52-100-67內(nèi)源ABA含量差異不顯著，6 h、12 h、18 h、24 h、48 h時(shí)原種HY52與HY52-100-23、HY52-100-67內(nèi)源ABA含量差異顯著。

種子吸脹萌發(fā)各時(shí)段HY52的ABA/GA高于HY52-100-23和HY52-100-67。0 h時(shí)原種HY52與HY52-100-23、HY52-100-67的ABA/GA差異不顯著，6 h、12 h、18 h、24 h、48 h時(shí)原種HY52與HY52-100-23、HY52-100-67的ABA/GA差異顯著(圖5)。說(shuō)明種子休眠與內(nèi)源GA含量呈負(fù)相關(guān)，與內(nèi)源ABA含量、ABA/GA呈正相關(guān)。

圖3 花生種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中GA變化 Fig.3 Changs in GA during peanut seed imbibition and germination

圖4花生種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中ABA變化

Fig.4 Changsin ABA during peanut seed imbibition and germination

圖5花生種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中ABA/GA變化

Fig.5 Changes in ABA/GA during peanut seed imbibition and germination

3 討 論

利用突變體研究種子休眠是一種非常有效的手段，通過(guò)這種方式鑒定出許多控制種子休眠的基因[10]。本研究以強(qiáng)休眠花生品種花育52號(hào)為試材，通過(guò)化學(xué)誘變方法，結(jié)合品質(zhì)示蹤和種子休眠性鑒定，獲得弱休眠突變材料，兩者之間品質(zhì)沒(méi)有差異，而種子發(fā)芽率存在顯著性差異，突變材料的創(chuàng)制為挖掘花生種子休眠分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

玉米種子萌發(fā)，胚中POD、CAT含量隨萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高[16]。強(qiáng)休眠玉米品種4628種子的過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)顯著低于休眠性差品種996；內(nèi)源激素赤霉素(GA)顯著低于休眠性差品種996，脫落酸(ABA)含量顯著高于休眠性差品種996[17]。本研究中發(fā)現(xiàn)，休眠性弱的突變材料POD、CAT與野生型野生型花育52號(hào)相比，種子吸脹萌發(fā)初期(0 h、6 h時(shí))差異不顯著，中期(12 h、18 h時(shí))顯著高于野生型花育52號(hào)。

種子休眠和萌發(fā)過(guò)程中，激素作為信號(hào)物質(zhì)扮演非常重要的角色，是調(diào)節(jié)生理活動(dòng)的重要物質(zhì)。ABA對(duì)誘導(dǎo)種子休眠和維持吸脹種子的休眠狀態(tài)有積極的調(diào)控作用，GA對(duì)終止種子休眠與促進(jìn)發(fā)芽有著重要的作用[18-21]。已有研究表明吸脹萌發(fā)過(guò)程，花生種子休眠與內(nèi)源GA含量、GA/ABA呈負(fù)相關(guān)，與內(nèi)源ABA含量呈正相關(guān)[22]。本研究得出相似結(jié)果，即種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中，休眠品種HY52內(nèi)源ABA含量顯著高于弱休眠突變材料(0h除外)；但休眠品種HY52內(nèi)源ABA含量變化趨勢(shì)存在一定差異，這可能是其種子休眠不同造成的[22]。種子吸脹萌發(fā)過(guò)程，弱休眠突變材料內(nèi)源GA含量從12 h時(shí)開始顯著高于休眠品種HY52，而ABA和ABA/GA從6 h時(shí)開始顯著低于休眠品種HY52，表明ABA和ABA/GA對(duì)于種子休眠的響應(yīng)可能更早一些。

4 結(jié) 論

本研究利用化學(xué)誘變方法創(chuàng)制出弱休眠突變材料，與野生型相比，品質(zhì)變化不顯著，種子萌發(fā)率存在顯著性差異；種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中，突變材料與野生型在POD、CAT、GA、ABA和ABA/GA方面表現(xiàn)有一定差異。種子吸脹萌發(fā)初期，弱休眠突變材料與強(qiáng)休眠野生型的POD、CAT、GA、ABA、ABA/GA差異不顯著，中期弱休眠突變材料的POD、CAT、GA顯著高于強(qiáng)休眠野生型花育52號(hào)，而ABA、ABA/GA顯著低于強(qiáng)休眠野生型花育52號(hào)；后期弱休眠突變材料的CAT和GA顯著高于強(qiáng)休眠野生型花育52號(hào)，而ABA、ABA/GA顯著低于強(qiáng)休眠野生型花育52號(hào)。