補骨脂對牙周炎大鼠牙移動保持期OPG表達的影響

宋春蕾 趙剛 王明明 宋佳

【摘要】 目的：觀察牙周炎大鼠牙移動保持期間，采取灌胃補骨脂水煎液對牙周組織中OPG表達情況。方法：按照隨機數(shù)字表法將45只建立牙周炎的雄性大鼠分為三組，每組15只?？瞻讓φ战M：建立牙移動模型后處死。實驗組和陰性對照組：牙移動模型建立后去除拉簧，安放保持裝置，各保持3、7、14、21 d。實驗組在保持期內灌胃補骨脂水煎液，陰性對照組灌服等量生理鹽水。制作免疫組化切片，觀察上頜第一磨牙遠中側牙周組織OPG的表達情況。結果：陰性對照組在早期變化不顯著，3 d后不斷增加，實驗組在整個保持階段OPG的表達呈不斷增加的趨勢。在同一時段進行對比，實驗組OPG的表達均明顯大于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：補骨脂水煎液可提高牙周炎大鼠牙移動后牙周OPG的表達，加快牙周改建。

【關鍵詞】 補骨脂； 牙周炎； 牙移動； 保持； OPG

【Abstract】 Objective：To observe the expression of OPG in periodontal tissues during the retention period after tooth movement in the rats with periodontitis.Method：According to random number table method，45 male rats with established periodontitis were divided into 3 groups，15 rats in each group.The blank control group：rats were sacrificed after the establishment of tooth movement model.The experimental group and the negative control group：after the establishment of tooth movement model，the reed spring was removed，the retainer were maintained 3，7，14，21 days.The experimental group was orally administered with Psoralen Water Decoction during the retention period，the negative control group was given the same amount of Normal Saline.Immunohistochemical section was made to observe the expression of OPG in the distal periodontal tissue of maxillary first molar.Result：In the negative control group，the change was not significantly at the early stage and increased continuously after 3 days，the expression of OPG increased continuously in the experimental group showed an increasing trend during the whole retention period.The OPG expression at all time points of the experimental groups were significantly higher than that in the negative control group（P<0.05）.Conclusion： Psoralea Water Decoction can improve the expression of OPG in periodontal tissue of rats with periodontitis during the retention period after tooth movement and accelerate the repair of periodontal tissue.

【Key words】 Psoralea Corylifolia Linn； Periodontitis； Tooth movement； Retention； Osteoprotegerin

First-authors address：Oral Medicine College Jiamusi University，Jiamusi 154000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.15.008

隨著經濟社會的發(fā)展，人們對于美觀的要求不斷提高，存在錯頜畸形癥狀的成人正畸患者數(shù)量逐年增加，其中多數(shù)患者伴有不同程度的牙周疾病。由于牙周炎會導致牙周支持組織的病損，正畸主動治療后牙周組織的恢復與適應將需要更長的時間。如何將中藥應用于正畸領域，近年來逐漸引起研究人員的關注。中草藥補骨脂（Psoralea Corylifolia Linn）為豆科類植被，味辛、苦，大溫，無毒，有補腎行氣、縮尿止帶、健脾止瀉的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明其不僅具有雌激素樣作用，還具有促進骨形成和抑制骨吸收的作用[2]。同時補骨脂因其藥效，對預防骨質疏松癥也有作用[3-5]。由成骨類細胞分泌的OPG（Osteoprotegerin），能抑制破骨細胞（Osteoclast，OC）形成和激活，減少牙槽骨破骨性的吸收。本文實驗擬通過將補骨脂水煎液應用在牙周炎大鼠牙移動保持期，觀察OPG表達變化，研究補骨脂在炎性牙周改建過程中的作用，為牙周炎患者正畸后縮短保持時間提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 每1 000 mL水中加100 g補骨脂干燥果實（購自陜西，經黑龍江中醫(yī)藥大學中藥研究所鑒定符合2015版《中國藥典》補骨脂質量控制標準）浸泡30 min，加熱至沸騰半個小時后濾渣，將濾液濃縮至100 mL，即制成100%濃度的水煎劑，備用（含1 g生藥/mL）。DAB顯色劑、兔抗多克隆一抗（武漢博士德生物工程有限公司），二抗PV6001（北京中杉金橋生物科技有限公司）。

1.2 實驗動物 選用8周齡健康雄性Wistar大鼠50只[購于佳木斯大學動物實驗中心，許可證號：SCXK（黑）2013-001]，體重（220±20）g，適應環(huán)境1周后開始實驗，最終納入45只。

1.3 方法

1.3.1 分組 按照隨機數(shù)字表法將45只建立牙周炎的大鼠分為3大組，每組15只，共9小組。空白對照組：將建立牙周炎后的大鼠牙移動21 d后處死。陰性對照組和實驗組：各4小組（每一保持時間點設置1小組），牙周炎大鼠牙移動21 d后去除加力拉簧，在上頜左側第一磨牙與前牙間安放保持器，分別保持3、7、14、21 d，于保持前1 d以補骨脂水煎液開始灌胃實驗組大鼠，劑量為5.6 g/kg（約5.6 mL），1次/d，直到處死。無菌生理鹽水等量灌胃陰性對照組大鼠。

1.3.2 動物實驗模型的建立

1.3.2.1 建立大鼠牙周炎模型 以10%水合氯醛（佳木斯大學口腔醫(yī)院藥房提供）腹腔注射大鼠（3.5 mL/kg），動物安靜后仰臥于操作臺，拴牢頭部和四肢，用自制開口器暴露視野，使用快速手機在大鼠雙側第一磨牙頸部頰腭方向靠近齦緣的地方制備一0.2 mm深固位溝，用0.2 mm結扎絲（正畸用型號）分別圍著大鼠第一磨牙頸部一圈實施結扎，在腭方結扎并將結扎頭盡量埋入齦溝里，待大鼠清醒后飼以高糖飲食4周。每天檢查，如有損壞丟失及時重置。

1.3.2.2 建立大鼠牙移動模型 參照林鵬等[6]的方法，在大鼠上頜兩顆前牙的唇舌面以及遠中側距離齦緣約0.5 mm處用快速手機磨出約0.2 mm的深溝。用0.2 mm正畸鋼絲穿入鎳鈦拉簧后，一端通過前兩顆磨牙之間于腭側結扎，另一端嵌入中切牙固位溝內，用測力計測量，對第一磨牙向近中施加約50 g力后唇側結扎，并用玻璃離子固定，連續(xù)牽拉21 d后去除拉簧。每天檢查口內裝置，如有損毀丟失應及時重置。

1.3.2.3 建立牙移動后保持模型 牽引21 d后去除大鼠口內裝置，以上頜左側牙弓作為保持側，在左側第一磨牙與中切牙間，使用0.25 mm正畸鋼絲安放保持裝置，右側不保持。分別保持3、7、14、21 d，每一時間點處死5只，保持期間每天檢查口內裝置，如有脫落及時補救[7]。

1.3.3 免疫組化 以過量水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉處死，解剖取出含磨牙區(qū)的上頜骨，修剪后固定于4%多聚甲醛液（北京鼎國昌盛生物技術有限公司，編號：AR-0211）24 h。之后浸泡于10%EDTA液（廣州行知生物科技有限公司，編號：AAPR16-500）中于4 ℃脫鈣約50 d，PBS沖洗干凈組織塊后石蠟包埋。以平行牙體長軸，從腭側向頰側的方向進行切片，獲取近遠中方向切片，選擇斷面為完整牙周韌帶進行觀察。OPG表達量以平均光密度（OD值）代表，每例牙根遠中側隨機分析3個不同的高倍鏡視野，取其平均值，該值越大，代表OPG表達越強。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。采取多因素方差方法分析比較時間和藥物因素對OPG表達量的影響，LSD多重檢驗方法對各組內不同時間段OPG表達量分析對比，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2 結果

2.1 觀察免疫組化切片 OPG以淡黃色、淺棕色粒狀為主呈現(xiàn)于胞漿和胞質中，上頜第一磨牙遠中側牙周組織中都有OPG表達，且在牙槽骨表層的骨細胞以及牙周膜細胞中都可見不同程度的陽性表現(xiàn)。

2.2 大鼠正畸牙遠中側牙周OPG免疫組化分析統(tǒng)計 藥物和時間因素對牙周炎大鼠正畸牙遠中側牙周OPG表達的影響，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。陰性對照組OPG的表達在早期變化不顯著，3 d隨后不斷遞增，而實驗組在整個保持階段呈不斷遞增的趨勢。兩組在同一時段進行比較，在3、7、14、21 d比較，實驗組遠中側OPG的表達均明顯大于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

3 討論

牙周炎（chronicperiodontitis，CP）是一種由緊貼在牙根表面的菌斑生物膜引起的，呈現(xiàn)出慢性炎癥反應的疾病。其主要臨床特征是牙槽骨、牙周膜等牙周支持組織的破壞[8]。牙周炎患者正畸治療后，牙周組織修復要比正常患者需要更長的時間，才能使移動后的牙齒穩(wěn)固在新的位置上。為防止復發(fā)，有些牙周病損嚴重的患者需要長期甚至一生佩戴物理保持裝置。當前許多國內外研究證明采用藥物可以控制牙齒的移動，降低正畸后牙齒的復發(fā)，此類藥物包括西藥，如辛伐他?。⊿imvastatin）、二磷酸鹽等[9-10]。而中草藥從古至今被我國人們廣泛使用，相對于西藥，中藥不容易產生耐藥性，藥效溫和，毒副作用小等這些特點，使中藥的開發(fā)和利用逐漸得到國內外研究人員的關注，如淫羊藿、黃芩苷、川芎嗪等[11-13]。目前許多研究發(fā)現(xiàn)補骨脂活性成分能直接或間接的影響成骨相關因子的表達，加快成骨細胞（osteoblast，OB）增殖，或者通過上調OPG表達量，減緩OC的形成，間接地影響骨的代謝[14]。近年來，通過不斷探索補骨脂對牙周炎的影響發(fā)現(xiàn)，補骨脂能發(fā)揮雌激素樣作用，減緩牙槽骨的吸收，加快OB的增殖，增加牙槽骨密度，促進了受損牙周組織的重建[15]。此外，補骨脂還具有明顯的抗炎性，可抑制炎性細胞分泌的各種黏附因子和細胞因子的釋放[16]。

骨保護素（osteoprotegerin，OPG）亦名OC生成抑制因子，經分子克隆技術發(fā)現(xiàn)的一種與骨密度調節(jié)有關的分泌性糖蛋白，是TNF超家族的一種受體。OPG可作為誘餌與RANK競爭性的結合RANKL，導致與OC表面受體RANK相結合的RANKL數(shù)量的減少，抑制了OC的增殖分化及成熟，使OC的生成量相對降低，減緩了骨的吸收[17]。OPG在口腔中遍布較為廣泛，牙周支持組織均可以測到OPG的表達[18]。因此，OPG可以作為衡量骨改建活躍程度的一個指標。牙周炎可打破骨代謝的均衡，導致牙周骨組織吸收。動物實驗研究表明，OPG是牙周炎的重要調節(jié)因子，其參與牙周炎骨組織吸收活動。鐘雯怡等[19]將重組人骨保護素（rhOPG）局部注射于牙周炎大鼠磨牙牙周袋間隙，發(fā)現(xiàn)牙周炎大鼠牙槽骨中OPG表達量明顯提高，RANKL的表達量降低，這可能是改變了受損牙牙周骨組織重建過程中OPG/RANKL的平衡，使成骨大于破骨，有助于牙周炎患者受損牙周骨組織的修復。

通過動物實驗研究，以補骨脂水煎液劑量為5.6 g/kg（約5.6 mL）給予大鼠灌胃，結果發(fā)現(xiàn)補骨脂可以抑制OB和骨髓基質細胞RANKL表達，增加OPG表達量，表明中藥補骨脂可加快成骨作用[20]。本文以此為依據，實驗研究發(fā)現(xiàn)，實驗組牙周炎大鼠隨著用藥時間的增加，OPG表達水平逐漸提高；在同一時間段組間比較，使用傳統(tǒng)結扎絲進行物理保持的對照組牙周炎大鼠，其OPG表達水平均低于實驗組，說明在大鼠正畸牙保持期間，通過灌胃給予補骨脂水煎液能夠促進牙周炎大鼠牙周組織中OPG蛋白的表達，這有助于加快成骨細胞的成骨活動，增加牙槽骨的骨量，從而使移動后的牙齒能夠更早地穩(wěn)固在新的位置。

本實驗采用的補骨脂使用廣泛，并具有促骨形成作用的中藥，將其應用到牙周炎患者正畸治療后牙齒的保持階段，與傳統(tǒng)物理保持相配合下，該中藥能夠縮短牙周炎患者正畸治療后牙齒的保持時間，使正畸治療后的效果得到鞏固和維持，降低復發(fā)的可能性，使正畸患者接受正畸治療的整個時間得到縮短。目前隨著對中藥補骨脂的深入研究，其包含的眾多有效成分被不斷開發(fā)和利用，相信在口腔正畸領域也將會有巨大的應用價值。

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