DNA快速檢驗(yàn)在法庭科學(xué)中的研究進(jìn)展

李 甫，王穎希，焦章平,*

(1.北京市東城區(qū)公安司法鑒定中心，北京 100061；2.北京市公安司法鑒定中心，北京 100192)

DNA鑒定在刑事偵查中能夠起到認(rèn)定嫌疑人、提供偵破線索、串并案件、排除犯罪嫌疑、為法庭提供證據(jù)等作用。DNA鑒定技術(shù)自1985年被應(yīng)用于法庭科學(xué)以來(lái)，歷經(jīng)DNA長(zhǎng)度多態(tài)性和DNA序列多態(tài)性檢驗(yàn)，如可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（VNTR、也稱DNA指紋）、短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、線粒體DNA（mtDNA）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）等主要技術(shù)，廣泛應(yīng)用于法醫(yī)物證領(lǐng)域的個(gè)體識(shí)別與親緣鑒定。隨著其個(gè)體識(shí)別鑒定能力的不斷提高，檢驗(yàn)速度也漸趨加快，而由以前的6～8周縮短為數(shù)小時(shí)。目前，常規(guī)DNA檢驗(yàn)包括DNA提取、DNA定量、PCR擴(kuò)增及電泳分離檢測(cè)等多個(gè)步驟，整個(gè)過程大約需要8～10 h。但刑事案件對(duì)更快偵破速度的追求是無(wú)止境的。本文試探索分析DNA鑒定如何跟隨技術(shù)發(fā)展進(jìn)步實(shí)現(xiàn)快速檢驗(yàn)。

1 DNA快速提取

DNA提取是DNA檢驗(yàn)的第一步，目的是將證據(jù)材料或細(xì)胞中的DNA分子釋放出來(lái)，并與蛋白質(zhì)、核酸酶等其他細(xì)胞成分或干擾物分離，從而可將DNA制備成后續(xù)檢驗(yàn)所需要的形態(tài)。

1.1 血斑、唾液斑、脫落細(xì)胞類檢材

法醫(yī)DNA原先使用有機(jī)提取法和Chelex-100法[1]，但隨著檢材類型的豐富和數(shù)量的激增，這兩種方法已不能滿足高通量自動(dòng)化工作站的要求。目前，提取DNA主要使用磁珠法，利用全自動(dòng)核酸提取純化儀可實(shí)現(xiàn)常規(guī)檢材DNA的高通量提取，所需時(shí)間約 2～4 h。

2003年，Moss等[2]報(bào)道了利用來(lái)自南極芽孢桿菌EA1的中性蛋白酶提取DNA的方法。該酶在二價(jià)陽(yáng)離子環(huán)境中穩(wěn)定，可在75 ℃下裂解細(xì)胞而釋放出DNA并同時(shí)降解核酸酶等蛋白質(zhì)。整個(gè)提取過程在一個(gè)封閉環(huán)境中進(jìn)行，無(wú)需樣本轉(zhuǎn)移，從而降低了交叉污染的可能性和微量模板的損耗。2013年，ZyGEM[3]公司（新西蘭）利用該原理研究開發(fā)了PDQeX2400高速核酸提取儀，該儀器通量為24道，可以在7～20 min內(nèi)對(duì)血斑、唾液斑、精斑、脫落細(xì)胞等常規(guī)檢材進(jìn)行提取與純化。較目前常規(guī)DNA提取方法縮短了至少75%的時(shí)間。2016年，國(guó)內(nèi)博坤公司應(yīng)用納米二氧化硅磁性復(fù)合微粒研發(fā)的磁珠提取試劑盒，以交聯(lián)技術(shù)將二氧化硅磁性納米粒子制備成微米尺寸的交聯(lián)體，所得二氧化硅磁性復(fù)合微粒表面具有納米級(jí)突起，能夠更大表面積地捕獲DNA，提高DNA的提取量，其處理96個(gè)樣本僅需60 min。

1.2 精斑

在性侵案件中，常為男女混合檢材，常規(guī)提取選用差異裂解法。第一步先消化女性陰道上皮細(xì)胞DNA，再消化男性精子細(xì)胞的DNA，而后進(jìn)行精子細(xì)胞DNA的常規(guī)提取，需耗時(shí)將近一天。差異裂解法成本低，是處理精液陰道混合液（斑）的主要方法，但是成功率很大程度上受檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)水平等主觀因素和檢材條件等客觀因素的影響。近年來(lái)，針對(duì)性侵案件中男女混合檢材，美國(guó)Promega公司研發(fā)了商品化試劑盒Differex? System，利用蛋白酶K結(jié)合相差分離及差速離心技術(shù)對(duì)混合斑中的精子和上皮細(xì)胞進(jìn)行分離提取，操作簡(jiǎn)易，分離純化僅需2 h[4-5]；也有人使用DNaseI結(jié)合堿性裂解法提取混合斑中的精子DNA[6]，整個(gè)過程只需一個(gè)離心管，避免了精子DNA損失，提高了成功率，且可在2 h內(nèi)操作完成[7]。Norris等[8]研發(fā)一種基于超聲差異提取的微流體裝置，首先清除混合斑中的上皮細(xì)胞，然后利用超聲能在14 min內(nèi)完成精子細(xì)胞與其他成分的分離。

微流控技術(shù)對(duì)于法醫(yī)物證檢驗(yàn)中常遇到的混合、微量等疑難檢材處理具有優(yōu)勢(shì)，可根據(jù)細(xì)胞間物理、化學(xué)性質(zhì)的差異，通過流體、電場(chǎng)、超聲等方式主動(dòng)富集樣本。歐元等[9]使用基于重力驅(qū)動(dòng)的微流控芯片，在玻璃-PDMS芯片上對(duì)混合樣本進(jìn)行分離，可在30 min內(nèi)分離出精子，且不會(huì)有上皮細(xì)胞進(jìn)入分離通道。美國(guó)Micro fluidic Systems公司研發(fā)的微流控芯片通過先用低能量超聲波選擇性裂解上皮細(xì)胞，再以高能量超聲波裂解精子細(xì)胞，因此達(dá)到自動(dòng)化差異裂解，可在3 h內(nèi)分別得到男性、女性的DNA[10]。

1.3 骨骼、牙齒類檢材

已報(bào)道的提取方法有Chelex-100法、有機(jī)提取法、CTAB 法、硅珠法等。上述方法需要脫鈣、孵育、有機(jī)純化等步驟，用時(shí)較長(zhǎng)，同時(shí)繁瑣的步驟也加劇了DNA的流失。苑美青等[11]報(bào)道使用壓力循環(huán)儀提取骨骼DNA，比實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法縮短了24 h以上，提取效率提高6%～49%。壓力循環(huán)儀基于流體靜力學(xué)原理，通過改變樣本周圍壓力，打破分子間相互作用，同時(shí)也有效減少了PCR抑制因素[12]。高林林等[13]使用AutoMate Express?（美國(guó) Applied Biosystems公司）自動(dòng)化工作站進(jìn)行骨骼、牙齒的DNA提取，成功率較高（骨骼93.9%、牙齒93.3%），其法具有取材量少（僅為手工提取樣本的1/10～1/8）、提取時(shí)間短（56 ℃消化2 h及自動(dòng)化提取30 min）、易于實(shí)現(xiàn)高通量（同時(shí)進(jìn)行13份檢材的提?。┖妥詣?dòng)化操作等優(yōu)勢(shì)。

2 DNA免提取

目前的商品化PCR試劑盒均具有較高的靈敏度及較強(qiáng)的抗抑制能力，對(duì)于大多數(shù)檢材可以免去提取過程，進(jìn)行直接擴(kuò)增。近年相繼有進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)商品化免提取的試劑盒研發(fā)上市。免提取試劑盒在PCR反應(yīng)液中添加了PCR反應(yīng)抗抑制物質(zhì)[14]，對(duì)于血紅素、鞣酸、腐殖酸等抑制物的耐受性很高。直接擴(kuò)增法的優(yōu)勢(shì)如下：1) 加快了檢測(cè)速度。省略了提取、純化等復(fù)雜步驟，節(jié)約了時(shí)間也有效地防止了提取過程的污染。2) 節(jié)約成本。無(wú)需提取、純化等步驟所需的相關(guān)耗材試劑。3) 檢材用量少。血卡、唾液卡及煙蒂僅需剪取1 mm×1 mm的小片，即可獲得滿意的結(jié)果。有文獻(xiàn)報(bào)道，直接擴(kuò)增法適用于多種檢材[15-16]，如血斑[17-18]、唾液斑[19]、脫落細(xì)胞[20]、毛發(fā)[21]、肋軟骨[22]等，均可根據(jù)檢材條件嘗試應(yīng)用直接擴(kuò)增法。

直接擴(kuò)增法在DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)[23]、DVI及群體性突發(fā)事件中，能夠顯著提高DNA檢驗(yàn)的速度。但是，直接擴(kuò)增法也有一定的局限性，不適用于模板量大以及微量、抑制物多的檢材。使用直接擴(kuò)增法時(shí)，電泳前要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行離心，將直擴(kuò)樣本沉入管底，或者將檢材載體挑出，切不可吸入載體，以防止堵塞電泳儀的毛細(xì)管。另外，DNA免提取也會(huì)縮短毛細(xì)管的使用壽命。

3 快速擴(kuò)增

試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）將AmpFlSTR?Sinoif ler?試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems公司）擴(kuò)增時(shí)間縮短至60 min以內(nèi)；2013年，劉琳等[26]通過比較4種快速PCR檢測(cè)試劑與AmpFlSTR?Identifiler?（美國(guó)Applied Biosystems公司）相結(jié)合，總結(jié)出分型結(jié)果清晰準(zhǔn)確、擴(kuò)增用時(shí)僅22min的快速PCR檢測(cè)方法；隨后他們將所建立的體系應(yīng)用于血卡的直接擴(kuò)增，得到了與常規(guī)提取、擴(kuò)增結(jié)果一致的STR分型[27]。2017年，Han等[28]報(bào)道了包含14個(gè)STR基因座和1個(gè)性別基因組的快速PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)只需37 min。

快速PCR主要從三個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)：聚合酶和添加劑的優(yōu)化、程序的完善以及熱循環(huán)儀的革新[24]。SpeedSTAR? HS DNA Polymerase（日本TaKaRa公司）、PyroStart? Fast PCR Master Mix（立陶宛 Fermentas公司）、Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix（美國(guó)Thermo Scientific公司）等產(chǎn)品都包含可加快PCR反應(yīng)的快速酶[29]?？焖貾CR儀的技術(shù)核心在于能提高PCR儀的升降溫速率并同時(shí)保持樣品與金屬槽溫度的一致性，從而達(dá)到縮短變性、退火、延伸等駐留時(shí)間的目的，常用的快速PCR儀有 C1000 Touch?PCR儀（ 美 國(guó) Bio-Rad公 司 ）、Mastercycler?PCR 儀（德國(guó) Eppendorf公司）、Piko?PCR儀（芬蘭Finnzymes公司）及SpeedCycler2PCR儀（德國(guó)analytikjena公司）。李甫等[30]報(bào)道使用SpeedCycler2 PCR儀可以在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，有效縮短擴(kuò)增時(shí)間，以Identifiler?Plus試劑盒為例，擴(kuò)增時(shí)間可從2 h 40 min縮短至1 h 20 min?？?/p>

PCR擴(kuò)增是獲得準(zhǔn)確STR分型的關(guān)鍵步驟，同時(shí)也是DNA檢驗(yàn)最耗時(shí)的環(huán)節(jié)。2012年，Laurin等[24]使用日本TaKaRa公司的快速PCR擴(kuò)增試劑對(duì) AmpFlSTR?Profiler Plus?試劑盒（美國(guó) Applied Biosystems公司）進(jìn)行優(yōu)化，將擴(kuò)增時(shí)間縮短至26 min；同年，王洪迪等[25]應(yīng)用Fast Cycling PCR Kit速檢驗(yàn)方法是近幾年隨著新產(chǎn)品及技術(shù)的發(fā)展而出現(xiàn)的，目前市面上有較多的商品化擴(kuò)增試劑盒，其擴(kuò)增時(shí)間大大縮短。

4 快速電泳

法醫(yī)物證實(shí)驗(yàn)室多數(shù)使用美國(guó)Applied Biosystems公司的遺傳分析儀，以使用Identifiler?Plus試劑盒為例，3130xL遺傳分析儀可以在45 min完成16個(gè)樣本的檢測(cè)，而3500xL遺傳分析儀35 min就可以完成24個(gè)樣本的檢測(cè)，對(duì)于整板96個(gè)樣本檢測(cè)來(lái)說時(shí)間可從4 h 30 min縮減至2 h 20 min。

平原等[31]自主研發(fā)了一種新型毛細(xì)管電泳凝膠EX-Q20，原理是在N,N-二甲基丙烯酰胺存在的溶液中合成丙烯酰胺-N,N二甲丙基烯酰胺，形成一種新型的準(zhǔn)互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)，以此解決傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳凝膠不能兼顧分離效果與自涂敷功能的難題。在3130xL遺傳分析儀上電泳一組樣本，EX-Q20膠用時(shí) 20 min，POP4膠 用 時(shí) 45 min。Connon等[32]在3130xL遺傳分析儀上用 POP6膠和22 cm毛細(xì)管替換POP4膠和36 cm毛細(xì)管，可以將電泳時(shí)間從45 min 減少至 24～28 min。

5 快速檢測(cè)儀

當(dāng)前法醫(yī)學(xué)DNA鑒定從提取到出結(jié)果需要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分步完成，每步前期處理都需要人工干預(yù)。如果可以做到“樣本進(jìn)-結(jié)果出”，就可在解放人力的同時(shí)也降低檢材在每一步驟中間轉(zhuǎn)移時(shí)可能存在的污染風(fēng)險(xiǎn)。微流控芯片技術(shù)（micro fluidics）又稱微型全分析系統(tǒng)（μTAS）或芯片實(shí)驗(yàn)室（lab on a chip），是指通過微納米加工，在一塊玻璃或塑料芯片上集成微管道、微泵、微電極等控制和傳感單元[33-35]，檢材對(duì)象包括核酸、蛋白、細(xì)胞、爆炸殘留物、毒物等[36]。該技術(shù)可以減少人工干預(yù)，實(shí)現(xiàn)集成化、自動(dòng)化和微型化。法醫(yī)物證中所涉及的微流控芯片包括細(xì)胞分離芯片、DNA提取芯片、PCR擴(kuò)增芯片、毛細(xì)管電泳芯片等功能模塊和多功能整合的芯片系統(tǒng)[37-38]，如PCR-毛細(xì)管電泳(CE)芯片、DNA提取-擴(kuò)增-電泳一體化芯片。

2008年，Liu等[39]研制了PCR-CE芯片，將DNA檢驗(yàn)設(shè)備放置于工作車上，現(xiàn)場(chǎng)提取血跡隨即在車上進(jìn)行檢驗(yàn)，將STR分型結(jié)果傳回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)，再將比對(duì)結(jié)果傳回現(xiàn)場(chǎng)，整個(gè)流程可在6 h以內(nèi)完成。后該實(shí)驗(yàn)室于2011年又研發(fā)了二代PCRCE微流控系統(tǒng)[40]，可同時(shí)檢測(cè)12份樣品的9個(gè)STR基因座，靈敏度達(dá)17～18個(gè)二倍體細(xì)胞DNA。2014年，Roux等[41]構(gòu)建了用于法醫(yī)STR快速分析的PCR-CE芯片，該系統(tǒng)采用一次性塑料芯片，以非接觸式紅外加熱方式45 min完成擴(kuò)增，能在7 cm的電泳芯片上15 min完成18個(gè)基因座的分離。目前已有商品化的全自動(dòng)基因分析儀面世。2013年美國(guó)IntegenX公司推出RapidHIT?200DNA快速檢測(cè)儀，結(jié)合PowerPlex?16HS試劑盒（美國(guó)Promega公司）可在90 min內(nèi)同時(shí)完成5～7份血斑、唾液斑等生物檢材的DNA檢驗(yàn)，分型結(jié)果可以導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)[42-46]。同年，GE公司（美國(guó)）與Network Biosystems公司（美國(guó)）合作推出了DNAScan快速DNA分析儀，可以在85 min內(nèi)完成5份生物樣本的16個(gè)基因座的DNA檢驗(yàn)[47]。2014年，LGC公司（英國(guó)）研發(fā)的ParaDNA?Screening系統(tǒng)通過樣本收集器可同時(shí)進(jìn)行4份樣本的制備，采用screening模塊對(duì)2個(gè)STR基因座和性別基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過探測(cè)探針的熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)DNA值，從而判斷STR分型的可能性，整個(gè)過程需要75 min。Ball等比較了ParaDNA?Screening系統(tǒng)和傳統(tǒng)STR試劑盒對(duì)381份樣本的分型一致性，可達(dá)98.4%，表明該系統(tǒng)可以輔助法醫(yī)DNA檢驗(yàn)人員進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

表1 常見商品化快速檢測(cè)儀的比較Table 1 Comparison of DNA rapid detectors

6 總結(jié)

當(dāng)前，DNA鑒定技術(shù)在打擊犯罪、懲治罪犯中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。刑偵工作中，一般認(rèn)為距離案發(fā)時(shí)間越近鎖定嫌疑人，案件偵破的成功率就越高，反之則越低。隨著民眾法律意識(shí)的增強(qiáng)和“重證據(jù)、輕口供”的刑訴法法治思維方式的實(shí)踐，如何在有限的羈押期限內(nèi)獲得關(guān)鍵有力的證據(jù)證實(shí)犯罪，對(duì)DNA鑒定技術(shù)的時(shí)效性提出了更高要求。當(dāng)前“以審判為中心的訴訟制度改革”中證據(jù)裁判的法治原則對(duì)DNA鑒定技術(shù)的準(zhǔn)確性和可靠性也提出了更高的要求。如何快速而同時(shí)保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確與可靠，是未來(lái)新技術(shù)和新設(shè)備亟待解決的關(guān)鍵問題。一種新技術(shù)、新方法的出現(xiàn)，往往需要大量、反復(fù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證才能應(yīng)用于實(shí)際案件的檢驗(yàn)中。上述所有可縮短DNA檢驗(yàn)時(shí)間的方法均是相關(guān)從業(yè)人員所關(guān)注的熱點(diǎn)，許多方法仍有不足之處，需要業(yè)內(nèi)人員共同研究攻克，但縮短DNA檢驗(yàn)時(shí)間不能以減少通量及加長(zhǎng)檢驗(yàn)人員樣本預(yù)處理時(shí)間為代價(jià)?？梢灶A(yù)見，越來(lái)越多的DNA快速檢驗(yàn)設(shè)備必然會(huì)大量涌現(xiàn)，將朝著高通量、集成化、輕量化、操作簡(jiǎn)便的方向發(fā)展，這將會(huì)使非專業(yè)技術(shù)人員也能在現(xiàn)場(chǎng)、短時(shí)間內(nèi)完成全部DNA的檢驗(yàn)。