雷帕霉素對動脈粥樣硬化小鼠斑塊面積影響及機制探討*

王青龍，姜希娟，范英昌，龐曉麗

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院，天津 300193）

動脈粥樣硬化（AS）是冠心病、腦梗死、外周血管疾病的主要原因。研究顯示炎癥反應(yīng)可以促進粥樣斑塊進行性發(fā)展，繼而破裂出血引發(fā)急性心腦血管事件[1]。因此，控制炎癥反應(yīng)可抑制斑塊的發(fā)生發(fā)展。近年來，很多學(xué)者認為AS屬于慢性免疫－炎癥反應(yīng)[2－3]，從免疫角度探討AS發(fā)生發(fā)展中的炎癥反應(yīng)機制成為目前研究的熱點之一。雷帕霉素作為一種免疫抑制劑，在抗AS方面的研究已經(jīng)取得了一些進展[4－5]。然而，其具體作用機制尚未完全闡明。故實驗通過建立小鼠動脈粥樣硬化模型，探討雷帕霉素對粥樣斑塊面積的影響及機制，以期為臨床研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 藥物準備 根據(jù)說明書，基于體表面積換算人鼠等劑量，并將藥物溶入適量生理鹽水中。

1.2 實驗動物與分組 選取健康A(chǔ)poE基因敲除（ApoE－/－）雄性小鼠 30 只，體質(zhì)量 25～30 g，6～8 周齡（國家衛(wèi)生研究院提供）。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為3組：模型組10只、雷帕霉素組（RAPA）10只，陽性藥物（瑞伐他?。┙M10只，另飼養(yǎng)C57小鼠10只作為空白對照組?？瞻讓φ战M給予正常飲食，其他3組均給予高脂飲食12周。12周后，RAPA組和陽性藥物組給予相應(yīng)劑量藥物灌胃4周，模型組與空白對照組給予等劑量生理鹽水灌胃4周。4周后處死取材。

1.3 觀察方法與指標 1）處死小鼠后取主動脈竇斑塊，冰凍連續(xù)切片后油紅O染色，觀察各組斑塊內(nèi)脂質(zhì)情況。2）取主動脈竇及主動脈弓斑塊，石蠟連續(xù)切片后蘇木精－伊紅（HE）染色,利用圖像分析儀評估斑塊面積。3）取小鼠外周血，離心后取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定外周血中腫瘤壞死因子 α（TNF－α）、γ 干擾素（INF－γ）、白介素－6（IL－6）、白介素－10（IL－10）、轉(zhuǎn)化因子 β（TGF－β）含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法行配對t檢驗，以P＜0.05定為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 油紅O染色 模型組、雷帕霉素組及陽性藥物組均形成動脈粥樣硬化斑塊，其中模型組形成的粥樣斑塊具有較大脂核，見圖1。

圖1 各組斑塊主動脈竇油紅O染色（×40）Fig.1 Aortic sinus imaging of Oil red staining among groups（×40）

圖2 各組斑塊主動脈弓HE染色（×40）Fig.2 Aortic arch imaging of Hematoxylin and eosin among groups（×40）

2.2 斑塊面積 基于HE染色利用圖像分析儀計算各組斑塊面積及占管腔的百分比。結(jié)果顯示，與模型組比較，雷帕霉素組斑塊面積及狹窄程度明顯小于模型組，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；瑞伐他汀組雖然斑塊面積與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但在狹窄程度方面有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。雷帕霉素組與瑞伐他汀組比較，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

表1 各組斑塊面積及占管腔面積百分比比較（±s）Tab.1 Comparison of the plaque area and lumens area account among groups（±s）

表1 各組斑塊面積及占管腔面積百分比比較（±s）Tab.1 Comparison of the plaque area and lumens area account among groups（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別模型組RAPA組瑞發(fā)他汀組動物數(shù)10 10 10斑塊面積（mm2） 斑塊面積百分比（%）651.30±145.81 0.384±0.500 502.32±184.75* 0.297±0.600**625.82±170.46 0.339±0.400*

2.3 外周血中 TNF－α、INF－γ、IL－6、IL－10、TGF－β含量 結(jié)果顯示，模型組與空白對照組比較，促炎因子明顯升高，而抗炎因子明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；雷帕霉素組與模型組比較能有效降低促炎因子含量，增加抗炎因子表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；瑞伐他汀組與模型組比較除IL－10外，差異均勻統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

3 討論

近年來很多學(xué)者認為AS屬于慢性免疫－炎癥性疾病，斑塊內(nèi)大量巨噬細胞、淋巴細胞（主要為CD4+T細胞）、炎癥因子聚集引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致斑塊進行性發(fā)展[6－7]。研究顯示，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路激活后可促進巨噬細胞增殖、遷移及CD4+T淋巴細胞向效應(yīng)性T細胞分化，進而導(dǎo)致AS炎癥反應(yīng)放大[5，8]。因此，調(diào)控mTOR通路可抑制免疫炎癥反應(yīng)，進而抑制AS斑塊進展。

表2 各組外周血中炎癥因子含量測定比較(x±s)Tab.2 Comparison of inflammatory factors in peripheral blood among groups(±s)pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白對照組模型組RAPA組瑞伐他汀組動物數(shù)10 10 10 10 TNF－α INF－γ IL－6 IL－10 TGF－β 1 237.19±331.84 1 112.14±399.52 1 341.82±336.34 553.23±126.18 976.89±161.77 2 438.26±920.70* 1 778.02±177.12* 1 963.73±387.36* 411.43± 20.98* 484.52±152.52**1 054.38±273.69# 1 055.50±108.16## 1 541.07±107.77# 481.26± 38.21# 1 031.66±193.83##1 065.59±347.33# 1 208.98± 61.40# 1 446.71±268.97# 476.90± 68.11 1 104.39±294.54##

雷帕霉素為免疫抑制劑，可通過抑制mTOR通路達到控制免疫反應(yīng)的作用[4]。本研究油紅O及HE染色顯示，雷帕霉素組斑塊脂核明顯小于模型組?；贖E染色圖像分析結(jié)果證明，該藥可有效減小動脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)斑塊面積，降低血管狹窄程度，與臨床治療AS陽性藥物－他汀類效果相同。說明一方面，AS進展過程中確實存在免疫反應(yīng)；另一方面，這種免疫反應(yīng)與mTOR通路關(guān)系密切。

在免疫引發(fā)的炎癥反應(yīng)方面，研究表明mTOR通路激活后，一方面可促進巨噬細胞增殖，增殖的巨噬細胞會釋放大量炎癥因子如TNF－α、INF－γ、IL－6 等，加劇 AS 炎癥反應(yīng)[6，9]。另一方面，可促進CD4+T亞群細胞向效應(yīng)性T細胞分化，降低調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）數(shù)量，進而導(dǎo)致Treg細胞分泌的抗炎因子 IL－10、TGF－β 表達降低，炎癥反應(yīng)放大[10－11]。本研究結(jié)果顯示，雷帕霉素可有效降低動脈粥樣硬化小鼠外周血中 TNF－α、INF－γ、IL－6 含量，增加 IL－10、TGF－β含量。因此，推測這可能與該藥抑制巨噬細胞增殖、增加Treg細胞數(shù)量有關(guān)。綜上所述，雷帕霉素可通過增加抗炎因子含量、降低促炎因子含量來調(diào)控炎癥反應(yīng)，進而抑制斑塊發(fā)展，降低血管狹窄程度。

總之，雷帕霉素為抗真菌感染、抗移植免疫反應(yīng)藥物，在治療AS方面的研究尚處于起步階段。本研究從炎癥角度探討該藥對AS的作用機制，但在免疫炎癥具體作用靶點方面還需進一步研究。