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    miR-34a靶向調(diào)控c-MET促進(jìn)胰腺癌發(fā)展的分子機(jī)制及臨床意義

    2018-08-28 12:14:02倪晨明邵卓倪燦榮熊杰王歡胡昊金鋼
    中華胰腺病雜志 2018年4期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶胰腺癌病理

    倪晨明 邵卓 倪燦榮 熊杰 王歡 胡昊 金鋼

    微小RNA(microRNA,miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為21~25個(gè)核糖核苷酸的非編碼內(nèi)源性小單鏈RNAs分子,通過(guò)與靶基因3′末端非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合調(diào)控其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平,廣泛參與多種細(xì)胞生理和病理過(guò)程,如細(xì)胞周期、凋亡、分化等[1-2]。miR-34a是經(jīng)典的抑癌微小RNA[3-5]。為此,本研究檢測(cè)胰腺癌BxPC3細(xì)胞、胰腺癌組織及匹配的癌旁正常組織miR-34a表達(dá),明確miR-34a調(diào)控的靶基因,分析miR-34a及其靶基因的表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及對(duì)BxPC3細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。

    資料與方法

    一、組織標(biāo)本及胰腺癌細(xì)胞株培養(yǎng)

    選取2013年3月至2016年6月間上海長(zhǎng)海醫(yī)院肝膽胰外科行手術(shù)切除的148例經(jīng)病理證實(shí)的胰腺癌組織標(biāo)本,其中男性75例,女性73例,年齡40~85歲,中位年齡61歲。高中分化102例,低分化46例;TNM分期Ⅰ~Ⅱ期138例,Ⅲ~Ⅳ期10例。取同期配對(duì)的癌旁經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞的正常胰腺組織20例。所有入組患者術(shù)前均未接受任何針對(duì)腫瘤的治療。

    人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所,常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,分為對(duì)照組、miR-34a過(guò)表達(dá)組(miR-34a組)和c-MET基因沉默組(c-METsi組)。

    二、方法

    1.miR-34a結(jié)合位點(diǎn)的確定:利用Targetscan在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)c-MET的3′非編碼區(qū)(3′-UTR)存在miR-34a結(jié)合位點(diǎn)。采用Promega公司的pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression系統(tǒng)構(gòu)建c-MET-3′UTR雙熒光素酶(luciferase)報(bào)告載體,按說(shuō)明書(shū)分別克隆c-MET的野生型3′UTR及突變型3′UTR。采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BxPC3細(xì)胞,獲取firefly熒光素值與Renila熒光素信號(hào)值,以?xún)烧弑戎当硎緹晒馑孛富钚裕詫?duì)照組的活性為100%計(jì)算。

    2.miR-34a組及c-MET si組BxPC3細(xì)胞株建立:miR-34a mimic及c-MET siRNA均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)公司,采用脂質(zhì)體方法將它們分別轉(zhuǎn)染BxPC3細(xì)胞。Lipofectamine 3000購(gòu)自Invitrogen Life Technologies公司,按說(shuō)明書(shū)操作。

    3.miR-34a及c-MET mRNA表達(dá)檢測(cè):應(yīng)用miRNeasy Mini Kit(Qiagen公司,Cat.217004)抽提各組細(xì)胞總RNA;應(yīng)用miRNeasy FFPE Kit(Giagen公司,Cat. 217504)抽提石蠟組織標(biāo)本總RNA。miR-34a檢測(cè)先用TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems Life Technologies公司,Cat. 4366596)反轉(zhuǎn)錄,再用TaqManTMUniversal Master Mix II, with UNG(Cat. 4440038)及miR-34a Taqman探針(Assay ID:000425)行莖環(huán)特異性熒光定量PCR反應(yīng)。c-MET mRNA檢測(cè)先用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa公司,Cat. RR037A)反轉(zhuǎn)錄,再用 SYBR?Advantage?qPCR Premix(TaKaRa公司,Cat. 639676)行熒光定量PCR反應(yīng)。c-MET上游引物序列5′ -GTAAGTGCCCGAAGTGTA-3′,下游引物序列5′-TTTCTTGCCATCATTGTC-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物序列5′- TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′,下游引物序列5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。 以上所有操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用公式2-△△Ct計(jì)算mRNA表達(dá)量。

    4.c-MET蛋白表達(dá)檢測(cè): 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用裂解液抽提細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用BCA法定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)c-MET蛋白表達(dá),以GAPDH為內(nèi)參。抗c-MET、GAPDH抗體均購(gòu)自CST公司,最后ECL發(fā)光,X片曝光、顯影、定影。用Image J軟件分析,以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白表達(dá)量。

    取胰腺癌及匹配的癌旁組織切片,采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)c-MET蛋白表達(dá),以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。兔抗人c-MET多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司(Cad:ab74217,1∶50稀釋), 兔抗鼠HRP多聚物二抗購(gòu)自丹麥DAKO公司,DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。由2位病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片。高倍鏡下(×400)隨機(jī)觀察5個(gè)視野,胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為c-MET陽(yáng)性,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例(10%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分)及染色強(qiáng)度(無(wú)染色為0分,黃色為1分,深黃色為2分,褐黃色為3分)進(jìn)行評(píng)分,兩分值相乘,0~4分定為c-MET陰性,5~12分定為c-MET陽(yáng)性。

    5.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以每孔1×105細(xì)胞接種96孔板,分別培養(yǎng)1、2、3、4 d,每時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)到時(shí)間后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,上酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

    6.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次,上室內(nèi)加入1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液500 μl,下室加600μl含15% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液,常規(guī)培養(yǎng)24 h,棄去上室內(nèi)液體,用棉棒擦拭去上室底部隔膜表面覆蓋的細(xì)胞,隔膜用50%甲醇液固定15 min,PBS洗3遍,用結(jié)晶紫染色30 min,風(fēng)干,鏡下隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù),取均值。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    一、miR-34a直接作用靶點(diǎn)的證實(shí)

    對(duì)照組、miR-34a組c-MET野生型3′UTR細(xì)胞的熒光素酶活性分別為100%、(65.00±4.04)%,對(duì)照組、miR-34a組c-MET突變型的熒光素酶活性分別為100%、(106.70±7.27)%,miR-34a組c-MET野生型的3′UTR較對(duì)照組顯著下調(diào)(t=8.66,P=0.001),而c-MET突變型3′UTR與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.92,P=0.4107),證實(shí)c-MET是miR-34a的靶基因。

    二、各組細(xì)胞及胰腺癌和癌旁組織miR-34a、c-MET表達(dá)

    20對(duì)匹配的胰腺癌和癌旁正常胰腺組織miR-34a表達(dá)水平分別為0.026±0.003、0.050±0.005,癌組織顯著低于癌旁正常組織,平均下調(diào)1.92倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.03,P=0.003)。

    對(duì)照組、miR-34a組BxPC3細(xì)胞c-METmRNA表達(dá)水平分別為0.085±0.009、0.045±0.003;c-MET蛋白表達(dá)量為1.133±0.120、0.400±0.058(圖1),miR-34a組較對(duì)照組顯著下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.46,P=0.011;t=5.500,P=0.005)。

    圖1 對(duì)照組(1)、miR-34a組(2)BxPC3細(xì)胞 c-MET蛋白表達(dá)

    三、胰腺癌組織miR-34a、c-MET蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

    以所有胰腺癌標(biāo)本miR-34a表達(dá)的中位數(shù)為界分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,根據(jù)c-MET表達(dá)情況分為陽(yáng)性組和陰性組。圖2顯示了胰腺癌與癌旁正常胰腺組織c-MET的蛋白表達(dá)。miR-34a高表達(dá)、c-MET陽(yáng)性表達(dá)與胰腺癌TNM分期、腫瘤分化程度高度相關(guān),而與其他臨床病理參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性(表1)。

    圖2 胰腺癌(2A)及癌旁正常胰腺組織(2B)c-MET蛋白表達(dá)(免疫組化 ×200)

    表1 miR-34a、c-MET表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

    四、miR-34a、c-MET表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的影響

    對(duì)照組、miR-34a組和c-METsi組BxPC3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3,培養(yǎng)第4天,miR-34a組和c-METsi組較對(duì)照組的細(xì)胞增殖活力顯著下降(t=4.446,P=0.0012;t=7.869,P=0.0001);穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少(231±12比351±16,t=5.981,P=0.0039;259±7比351±16,t=5.181,P=0.0066;圖4),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    討 論

    miR-34a在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要作用,但其與胰腺癌關(guān)系報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)相比癌旁正常組織,miR-34a在胰腺癌組織明顯下調(diào);此外,本研究也發(fā)現(xiàn)低水平miR-34a與腫瘤分期及細(xì)胞分化程度成正相關(guān),提示miR-34a可能在胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)過(guò)程中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。高增殖活性是腫瘤重要的惡性生物行為之一[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)miR-34a可調(diào)控如胃癌[8]、卵巢癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]及膠質(zhì)瘤[11]等腫瘤細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌BxPC3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-34a后,細(xì)胞增殖活性顯著減弱。轉(zhuǎn)移是腫瘤生物學(xué)行為的另一個(gè)重要特征。本研究同樣發(fā)現(xiàn)胰腺癌BxPC3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-34a后,腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著降低,提示miR-34a對(duì)胰腺癌具有重要的抑制作用。

    圖3 對(duì)照組、miR-34a組和c-METsi組BxPC3細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

    圖4 對(duì)照組(4A)、miR-34a組(4B)和c-METsi組(4C)的穿膜細(xì)胞比較

    利用在線預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)c-MET的3′UTR存在miR-34a結(jié)合位點(diǎn)。c-MET是胰腺癌重要的預(yù)后因子,高水平的c-MET往往提示患者預(yù)后不良[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),c-MET與其配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合引起酪氨酸的自身磷酸化,激活多條信號(hào)通路,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲;此外c-MET還和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體一起協(xié)同參與新生血管的形成[14]。本研究發(fā)現(xiàn),c-MET在胰腺癌組織中陽(yáng)性率達(dá)33.7%(50/148),并且與胰腺癌臨床分期及細(xì)胞分化程度成正相關(guān);抑制c-MET表達(dá)后,細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力明顯下降,表明c-MET對(duì)胰腺癌有顯著的促進(jìn)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-34a可下調(diào)c-MET的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平;雙熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)也提示miR-34a可與c-MET的3′UTR直接作用而發(fā)揮抑制作用;組織檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)miR-34a與c-MET表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示胰腺癌發(fā)展過(guò)程中,逐漸下調(diào)的miR-34a不足以抑制c-MET表達(dá),導(dǎo)致其部分活化,而促進(jìn)胰腺癌發(fā)生。

    綜上所述,miR-34a在胰腺癌中低表達(dá),而其靶基因c-MET表達(dá)增高,兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān),并與臨床分期及腫瘤分化程度高度相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)miR-34a或抑制c-MET后可顯著減弱胰腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移活性,表明miR-34a的抑癌活性可部分通過(guò)抑制c-MET得以實(shí)現(xiàn),miR-34a及c-MET有望成為胰腺癌新的診治靶點(diǎn)。

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