根皮苷對(duì)蘋(píng)果采后灰霉病的影響

賀軍花，馬利菁，周會(huì)玲*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的侵染性真菌病害，在果蔬采后貯藏中具有很高的發(fā)生頻率，病原菌可通過(guò)機(jī)械傷口和花期兩種途徑侵染果蔬，潛伏至貯藏中后期發(fā)病[1]，給生產(chǎn)者造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還形成了一定的食品安全隱患。目前控制灰霉病發(fā)生主要是使用化學(xué)殺菌劑，但化學(xué)殺菌劑會(huì)在果實(shí)表面殘留，食品安全性得不到保障，長(zhǎng)期使用還會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性[2]。因此，探究蘋(píng)果自身成分對(duì)灰霉病的抑制作用并加以利用是防治灰霉病的重要解決途徑之一。

很多研究發(fā)現(xiàn)植物感染病原菌后體內(nèi)總酚含量上升，某些單體酚含量上升尤為顯著，酚類(lèi)物質(zhì)含量上升很可能是植物對(duì)病原菌應(yīng)答的重要機(jī)制，而單體酚是病害應(yīng)答和抗病的基礎(chǔ)[3]。根皮苷是根皮素的葡萄糖苷，屬于黃酮類(lèi)中的二氫查耳酮類(lèi)物質(zhì)[4]。根皮苷是蘋(píng)果屬植物中特有的一種酚類(lèi)物質(zhì)，大量存在于葉片、果實(shí)和種子中，提取工藝簡(jiǎn)單，可獲得性強(qiáng)，具有殺菌、抗氧化、抗癌、改善記憶力、降低血糖等[5-6]多種重要的生物活力，在食品、醫(yī)療保健以及化妝品行業(yè)中廣泛應(yīng)用。研究表明，根皮苷能抗植物的多種病原菌，如蘋(píng)果黑星病、火疫病等[7]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。張澤生等[8]研究表明，根皮苷能夠增強(qiáng)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活力，顯著延長(zhǎng)由高脂膳食導(dǎo)致氧化損傷的果蠅壽命。此外，根皮苷還可以抑制多元不飽和脂肪酸的氧化[9]，并作為平衡性核酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，起到抗癌、抗病毒和保護(hù)心血管等作用[10]。同時(shí)，根皮苷在殺菌、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、改善記憶等方面的作用也十分顯著[11]。但有關(guān)根皮苷能否直接抑制病原菌的生長(zhǎng)并作為外源激發(fā)子誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性反應(yīng)的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以體外接種B. cinerea研究根皮苷的抑菌作用，并通過(guò)分析發(fā)病過(guò)程中抗性相關(guān)酶活力和相關(guān)物質(zhì)含量變化，探究根皮苷對(duì)蘋(píng)果灰霉病的抑制作用，以期為根皮苷在采后病害抗性機(jī)理研究方面提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。將菌種在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，25 ℃下恒溫避光培養(yǎng)9 d后，用體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80的無(wú)菌水制成濃度約為106個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。

‘粉紅女士’蘋(píng)果（Malus domestica‘Pink Lady’）采于西北農(nóng)林科技大學(xué)白水實(shí)驗(yàn)站，要求大小均勻、成熟度、著色基本一致，無(wú)機(jī)械損傷和病蟲(chóng)害。

L-苯丙氨酸、二硫蘇糖醇、抗壞血酸、苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）美國(guó)Sigma公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、乙二胺四乙酸二鈉 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-LB型無(wú)菌操作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；BCD-236DT型冰箱 青島海爾股份有限公司；A11型液氮研磨儀 德國(guó)IKA公司；AUY220分析天平日本島津公司；5810R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 科大中佳公司；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)處理

在離體實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，最終確定1.0 g/L的根皮苷為活體實(shí)驗(yàn)的使用質(zhì)量濃度，并進(jìn)行下述處理：以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇擦拭果面，晾干后放入根皮苷溶液中浸泡20 min，取出后在室溫（20±1）℃下誘導(dǎo)12 h，對(duì)照組用清水浸泡。用直徑3 mm的消毒釘子在蘋(píng)果赤道部位陰陽(yáng)面均勻刺3 mm深的2 個(gè)傷口，在傷口處分別接種20 μL 106個(gè)/mL B. cinerea懸浮液，晾干后放入聚氯乙烯保鮮袋，室溫條件下放置。固定30 個(gè)果實(shí)，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病斑直徑，重復(fù)3 次。其余果實(shí)，定期（0.0、0.5、1.0、1.5 d和2、3、5、7、9 d）取病斑周?chē)?～2 cm內(nèi)健康果肉組織，用液氮迅速冷凍后磨成粉末，裝入錫箔紙袋中于-80 ℃保存，用于測(cè)定抗性相關(guān)酶活力及物質(zhì)含量。

1.3.2 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 發(fā)病率、抑菌率和病斑直徑的測(cè)定

菌落（病斑）直徑利用游標(biāo)卡尺進(jìn)行十字交叉法測(cè)定，取平均值。以病斑直徑大于等于3.5 mm確定為發(fā)病，發(fā)病率、抑菌率分別按式（1）、（2）計(jì)算。

1.3.2.2 PAL活力的測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine amonialyase，PAL）活力的測(cè)定參考Han Cong等[12]的方法，略有改動(dòng)。稱取1.0 g果肉，加入2 mL 0.1 mol/L、pH 8.7的硼酸提取緩沖液（含40 g/L PVP、2 mmol/L EDTA和5 mmol/L β-巰基乙醇），冰浴條件下研磨成勻漿，于4 ℃、12 000×g離心30 min，上清液為粗酶提取液，4 ℃保存?zhèn)溆?。? 支試管，分別加入3 mL 50 mmol/L、pH 8.8的硼酸緩沖液和0.5 mL粗酶提取液，然后于一支試管中加入0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸，另一支加入0.5 mL的蒸餾水作為對(duì)照。將2 支試管于37 ℃溫水中保溫60 min，使生成反式肉桂酸，以0.1 mL 6 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)。290 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定反應(yīng)管和對(duì)照管的吸光度，以每小時(shí)酶促反應(yīng)體系吸光度增加0.01作為一個(gè)酶活力單位，單位為U/（h·g），以鮮質(zhì)量計(jì)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

安徽地區(qū)復(fù)合肥較受農(nóng)民歡迎，加上冬小麥播種影響，復(fù)合肥市場(chǎng)供應(yīng)良好，價(jià)格相對(duì)比較樂(lè)觀。同時(shí)，受原料價(jià)格上漲影響，復(fù)合肥價(jià)格有上漲趨勢(shì)。有經(jīng)銷(xiāo)商反映，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民對(duì)于新型肥料抱有一定興趣，如果經(jīng)銷(xiāo)商能在銷(xiāo)售旺季做好推廣示范和知識(shí)普及，銷(xiāo)量有望進(jìn)一步提高，經(jīng)營(yíng)方面的壓力也將有所緩解。

1.3.2.3 POD、PPO活力的測(cè)定

過(guò)氧化物酶（peroxldase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的測(cè)定參考周曉婉等[13]的方法，POD活力在470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以每分鐘吸光度變化1定義為一個(gè)酶活力單位，結(jié)果以U/（min·g）表示；PPO活力在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以每分鐘吸光度變化1定義為一個(gè)酶活力單位，結(jié)果以U/（min·g）表示。結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2.4 總酚、類(lèi)黃酮含量的測(cè)定

總酚、類(lèi)黃酮的含量分別分別參考Toor[14]和González-Aguilar[15]等的方法測(cè)定。稱取1.0 g果肉，加入4 mL提取液（為體積分?jǐn)?shù)1% HCl-甲醇，4 ℃預(yù)冷），研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，在4℃下提取15 min，于4 ℃、12 000×g離心30 min。取上清液分別在280 nm和325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以每克鮮果肉在280 nm和325 nm波長(zhǎng)處的吸光度來(lái)表示，分別計(jì)作A280nm和A325nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2.5 木質(zhì)素含量的測(cè)定

參照周會(huì)玲等[16]的方法，以每克鮮果肉在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A’280nm）來(lái)表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2.6 H2O2含量的測(cè)定

H2O2含量的測(cè)定參照Takshak等[17]的方法，在390 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，單位為μmol/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Excel 2007軟件作圖。離體實(shí)驗(yàn)在ANOVA下用LSD分析法、活體實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體條件下根皮苷抑菌質(zhì)量濃度的篩選

菌落是微生物在固體培養(yǎng)基上以母細(xì)胞為中心生長(zhǎng)形成的可見(jiàn)集團(tuán)，其直徑是判斷微生物生長(zhǎng)狀況的最直觀指標(biāo)。由表1可知，根皮苷處理組菌絲生長(zhǎng)減慢，菌落直徑小于對(duì)照組，且隨著根皮苷質(zhì)量濃度的增加，對(duì)B. cinerea的抑制能力也增強(qiáng)。接種后第3天，0.8、0.9 g/L和1.0 g/L根皮苷處理組沒(méi)有菌落形成，對(duì)照組及0.5、0.6 g/L和0.7 g/L根皮苷處理組都有發(fā)病，但根皮苷處理組的菌落直徑顯著低于對(duì)照組，抑菌率分別為38%、59%和69%（P＜0.05）。接種后第4天和第6天，0.8 g/L根皮苷處理組和0.9 g/L根皮苷處理組分別有可見(jiàn)菌落形成，到第9天，1.0 g/L根皮苷處理組也并未有可見(jiàn)菌落形成。由此可見(jiàn)，根皮苷能夠直接抑制B. cinerea的生長(zhǎng)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 g/L時(shí)可以完全抑制B. cinerea孢子的萌發(fā)，無(wú)菌落形成。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選發(fā)現(xiàn)此質(zhì)量濃度也是活體處理的最佳質(zhì)量濃度，因此，選用1.0 g/L作為本實(shí)驗(yàn)根皮苷使用的質(zhì)量濃度。

表 1 根皮苷處理對(duì)體外接種B. cinerea菌落直徑的影響Table 1 Effect of phlorizin treatment on the colony diameter of B. cinerea in vitro

2.2 根皮苷對(duì)蘋(píng)果灰霉病的抑制作用

圖 1 根皮苷處理對(duì)‘粉紅女士’蘋(píng)果采后灰霉病發(fā)病率（a）和病斑直徑（b）的影響Fig. 1 Effect of postharvest phlorizin treatment on grey mold incidence (a)and lesion diameter (b) caused by B. cinerea in ‘Pink Lady’ apple fruits

發(fā)病率和病斑直徑是判斷防治效果的重要指標(biāo)，可直觀體現(xiàn)病害的發(fā)生情況。由圖1a、b可知，根皮苷處理對(duì)蘋(píng)果采后灰霉病發(fā)病率和病斑直徑擴(kuò)展有顯著的抑制作用（P＜0.05），未經(jīng)處理的果實(shí)在接種B. cinerea后發(fā)病率和病斑直徑迅速增大，而處理組發(fā)病率和病斑直徑增加較為緩慢。如圖2a所示，在接種后第1天，處理組和對(duì)照組均有發(fā)病，對(duì)照組發(fā)病率接近20%，而處理組不足3%，兩者之間差異極顯著（P＜0.01）。其后，對(duì)照組發(fā)病率持續(xù)增加，接種后第5天，發(fā)病率已接近100%，而處理組發(fā)病率僅為61.1%，相比對(duì)照組降低了38.3%，差異極顯著（P＜0.05）。至觀察后期，對(duì)照組全部發(fā)病，處理組發(fā)病率也繼續(xù)增加，但仍沒(méi)有全部發(fā)病，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。由圖2b可知，與發(fā)病率變化相似，接種B. cinerea后，對(duì)照組病斑直徑顯著高于處理組，在接種后第5天，對(duì)照組的病斑直徑就達(dá)到了11.10 mm，而處理組為9.53 mm，兩組相比差異顯著（P＜0.05）。其后，對(duì)照組的病斑直徑迅速擴(kuò)大，至測(cè)量后期達(dá)25.17 mm，而處理組病斑直徑顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），比對(duì)照減小了4.53 mm?？梢?jiàn)根皮苷處理可以有效降低蘋(píng)果采后灰霉病的發(fā)生率，并抑制病斑直徑的擴(kuò)展。

2.3 根皮苷對(duì)果實(shí)抗性相關(guān)酶活力的影響

圖 2 根皮苷處理對(duì)采后‘粉紅女士’蘋(píng)果果實(shí)抗性相關(guān)酶活力的影響Fig. 2 Effect of phlorizin treatment on resistance-related enzymes activities in postharvest ‘Pink Lady’ apples

PAL是許多中間抗菌物質(zhì)生成的關(guān)鍵酶，其活力強(qiáng)弱常被用作植物抗性反應(yīng)的重要指標(biāo)。如圖2a所示，經(jīng)過(guò)根皮苷處理的果實(shí)PAL活力整體較對(duì)照組高，且兩組酶活力都呈先升高后降低的趨勢(shì)。在0.5 d時(shí)，對(duì)照組和處理組都達(dá)到一個(gè)小高峰，對(duì)照組酶活力為304.9 U/（h·g），處理組比對(duì)照組約高34.2 U/（h·g），兩組差異極顯著（P＜0.01）。之后對(duì)照組和處理組的PAL活力均有所降低，在1.5 d時(shí)同時(shí)下降到一個(gè)極小值，但處理組酶活力仍較對(duì)照組高25.3%，兩者之間差異極顯著（P＜0.01）。之后PAL活力又開(kāi)始增加，并在2 d時(shí)達(dá)到峰值，后期緩慢下降，并趨于平緩。因此認(rèn)為，根皮苷作為外源激發(fā)子可有效誘導(dǎo)蘋(píng)果果實(shí)PAL活力的增加，以更好抵御灰霉菌入侵。

POD與植物體內(nèi)活性氧代謝和木質(zhì)素的合成緊密相關(guān)，可消除活性氧對(duì)植物細(xì)胞的傷害并催化木質(zhì)素的最后一步合成。如圖2b所示，處理組POD活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且兩組酶活力在整個(gè)時(shí)期都基本呈上升趨勢(shì)，在0.5 d時(shí)同時(shí)達(dá)到一個(gè)小峰值，之后酶活力基本保持不變，在3 d后兩組酶活力均迅速增加，處理組在7 d上升到峰值，比此時(shí)對(duì)照組酶活力高38.0%，兩者之間差異極顯著（P＜0.01）?？梢?jiàn)，外源根皮苷的使用可有效誘導(dǎo)POD活力的增加，以消除活性氧對(duì)果實(shí)細(xì)胞的傷害，并促進(jìn)木質(zhì)素的合成。

PPO與植物體酚類(lèi)代謝密切相關(guān)，可以將多種簡(jiǎn)單酚類(lèi)物質(zhì)氧化形成醌類(lèi)。如圖2c所示，在整個(gè)觀察期，PPO活力整體呈現(xiàn)先降低再上升后下降的趨勢(shì)，且處理組PPO活力始終較對(duì)照組高。在1.5 d時(shí)處理組PPO活力達(dá)到峰值，較此時(shí)對(duì)照組的酶活力高94.4%，兩組之間差異極顯著（P＜0.01）。之后酶活力開(kāi)始下降，到7 d后又有上升的趨勢(shì)。1 d時(shí)對(duì)照組PPO活力上升到一個(gè)峰值，仍然較此時(shí)的處理組酶活力低，兩組之間差異顯著（P＜0.05）。因此認(rèn)為，根皮苷處理可顯著誘導(dǎo)PPO活力的增加，促進(jìn)醌類(lèi)物質(zhì)的積累，抵御病害的脅迫。

2.4 根皮苷對(duì)果實(shí)抗性相關(guān)物質(zhì)含量的影響

圖 3 根皮苷處理對(duì)采后‘粉紅女士’蘋(píng)果果實(shí)抗性相關(guān)物質(zhì)含量的影響Fig. 3 Effect of phlorizin treatment on the contents of resistancerelated substances in postharvest ‘Pink Lady’ apples

總酚和類(lèi)黃酮是植物體內(nèi)直接的抑菌物質(zhì)，其含量的變化代表著植物對(duì)外界刺激的應(yīng)答能力。經(jīng)過(guò)根皮苷處理的果實(shí)中總酚含量整體高于對(duì)照組（圖3a）。在接種B. cinerea后，處理組總酚含量上升較快，1.5 d達(dá)到一個(gè)峰值，此時(shí)處理組的總酚含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。之后處理組的總酚含量有所下降，5 d時(shí)出現(xiàn)一個(gè)極小值，然后呈上升-下降的波動(dòng)趨勢(shì)。而對(duì)照組總酚含量整體呈緩慢上升的趨勢(shì)，在后期略有下降，再緩慢上升，至觀察末期仍有上升的趨勢(shì)。

如圖3b所示，與總酚含量變化相似，根皮苷處理組的類(lèi)黃酮含量整體較對(duì)照組高，且處理組和對(duì)照組類(lèi)黃酮含量總體呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì)。處理組類(lèi)黃酮含量在最初就較對(duì)照組高，其后兩組類(lèi)黃酮含量都有所增加，至接種1 d，處理組類(lèi)黃酮含量達(dá)到一個(gè)峰值，較此時(shí)對(duì)照組類(lèi)黃酮含量高18.0%，之間差異極顯著（P＜0.01）。其后處理組和對(duì)照組類(lèi)黃酮含量都有所下降，但處理組含量仍較對(duì)照組高。在2 d時(shí)，處理組和對(duì)照組類(lèi)黃酮含量都下降到一個(gè)較低水平，之后又開(kāi)始上升，雖然對(duì)照組較處理組上升快，但之間并無(wú)顯著差異（P＞0.01）。由此可見(jiàn)，根皮苷處理可有效增加果實(shí)體內(nèi)總酚和類(lèi)黃酮的積累。

木質(zhì)素作為植物防御系統(tǒng)的重要組成成分，在強(qiáng)固細(xì)胞壁和增加抗性上起十分重要的作用。經(jīng)過(guò)根皮苷處理的果實(shí)木質(zhì)素含量在整個(gè)觀察期都較對(duì)照組高（圖3c），兩者都是先升高到一個(gè)峰值，再下降后又升高。根皮苷處理組在1.5 d時(shí)木質(zhì)素含量積累到一個(gè)最大水平，比此時(shí)對(duì)照組木質(zhì)素含量高約69.5%，兩者之間差異極顯著（P＜0.01）。其后木質(zhì)素的積累逐漸減少，在第5天減少到一個(gè)極小值后又開(kāi)始增加，并在觀察末期達(dá)到與峰值接近的水平。對(duì)照組在2 d時(shí)達(dá)到一個(gè)極大值，之后迅速下降，第5天開(kāi)始，木質(zhì)素含量又快速積累，至第9天時(shí)上升到一個(gè)略低于處理組的水平?？梢?jiàn)根皮苷處理可有效增加果實(shí)木質(zhì)素的含量，以更好抵御灰霉病入侵。

植物在受到不良環(huán)境脅迫時(shí)，體內(nèi)迅速積累H2O2參與抗逆反應(yīng)的啟動(dòng)和誘導(dǎo)過(guò)程，直接或間接導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，加速細(xì)胞的衰老和解體。如圖3d所示，處理組和對(duì)照組H2O2含量整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且處理組H2O2含量整體較對(duì)照組低。接菌后處理組H2O2含量開(kāi)始上升，在1 d時(shí)達(dá)到峰值，與此時(shí)對(duì)照組的H2O2含量基本相同，之后處理組H2O2含量開(kāi)始下降，而對(duì)照組繼續(xù)上升，在1.5 d時(shí)達(dá)到一個(gè)峰值，較此時(shí)處理組含量高4.40 μmol/g，兩組之間差異極顯著（P＜0.01）。其后處理組和對(duì)照組H2O2含量都呈現(xiàn)上升-下降的波動(dòng)趨勢(shì)。因此認(rèn)為，根皮苷處理可有效降低H2O2的生成，降低膜脂過(guò)氧化程度，減緩果實(shí)的衰老死亡過(guò)程。

3 討 論

外源黃酮類(lèi)物質(zhì)處理蘋(píng)果果實(shí)可以有效減弱灰霉菌的致病能力，降低損傷接種B. cinerea果實(shí)的發(fā)病率和抑制病斑直徑的擴(kuò)展，并誘導(dǎo)果實(shí)中防御相關(guān)酶類(lèi)活力的升高和抗性相關(guān)物質(zhì)含量的增加[18]。根皮苷是黃酮類(lèi)物質(zhì)的重要組成成分，作為殺菌劑和抗氧化劑而廣泛應(yīng)用。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中所含根皮苷質(zhì)量濃度與B. cinerea的生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)（R2＝0.959）。隨著根皮苷質(zhì)量濃度的增大，對(duì)B. cinerea的抑制效果越明顯，B. cinerea菌落形成的時(shí)間延遲，直徑減小。當(dāng)根皮苷質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 g/L時(shí)，培養(yǎng)基上無(wú)B. cinerea菌落的形成。由此可見(jiàn)，1.0 g/L的根皮苷可完全抑制B. cinerea的生長(zhǎng)。通過(guò)活體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，1.0 g/L的根皮苷溶液浸泡處理可有效降低‘粉紅女士’蘋(píng)果果實(shí)發(fā)病率，抑制病斑直徑擴(kuò)展，顯著改善果實(shí)發(fā)病情況。在剛接種B. cinerea時(shí)，果實(shí)表面附著的根皮苷和滲透進(jìn)入果肉淺表面的根皮苷可接觸B. cinerea，對(duì)其起直接毒殺作用，在一定程度上可抑制病原菌在果實(shí)上的定植生長(zhǎng)。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，病原菌在果實(shí)上生長(zhǎng)繁殖，其侵染范圍由近及遠(yuǎn)、由外而內(nèi)，根皮苷的這種直接毒殺效果減弱，B. cinerea的入侵速率較初期顯著增加（P＜0.05），但處理組的病斑直徑仍然低于對(duì)照組，可見(jiàn)根皮苷處理能夠顯著改善果實(shí)灰霉病的發(fā)生情況。

PAL作為非特異酶參與了由多途徑激發(fā)子誘導(dǎo)植物的抗性反應(yīng)，可增強(qiáng)植物對(duì)不良因子的抵御能力[19]。本研究發(fā)現(xiàn)根皮苷處理組PAL活力整體較對(duì)照組高。在接菌0 d時(shí)，處理組的果實(shí)PAL活力較對(duì)照組高7.33%，之間差異顯著（P＜0.05）?？梢?jiàn)，根皮苷處理可直接誘導(dǎo)PAL活力增加，與病原菌的侵染與否無(wú)關(guān)。根皮苷對(duì)蘋(píng)果果實(shí)的這種誘導(dǎo)反應(yīng)可在B. cinerea剛?cè)肭謺r(shí)有效減緩B. cinerea的侵染速率。之后，處理組PAL活力整體仍較對(duì)照組高，可能一方面是根皮苷的繼續(xù)誘導(dǎo)作用，另一方面是果實(shí)本身對(duì)病原菌入侵的系統(tǒng)抗性反應(yīng)；而對(duì)照組酶活力的改變僅僅依靠果實(shí)的系統(tǒng)抗性反應(yīng)，因此顯著低于處理組的酶活力（P＜0.05）。這與以外源激發(fā)子處理甜瓜的結(jié)果相似[20]。PAL作為苯丙烷代謝途徑的第一關(guān)鍵酶，活力的改變是植物誘導(dǎo)抗性反應(yīng)的重要表現(xiàn)之一[21]，其下游途徑產(chǎn)生的酚類(lèi)和類(lèi)黃酮具有殺菌、抗病毒、清除自由基等多種生物活性，參與果實(shí)的防御反應(yīng)[22]。但植物體本身的酚類(lèi)物質(zhì)含量與抗性并不直接相關(guān)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的酚類(lèi)物質(zhì)的變化與抗病性密切相關(guān)[23]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)處理初期根皮苷處理組和對(duì)照組的總酚含量無(wú)顯著差異，而類(lèi)黃酮的含量差異顯著（P＜0.05）?？赡苁歉街谔O(píng)果果實(shí)表面的根皮苷通過(guò)氣孔和細(xì)胞間隙進(jìn)入果肉的淺表層，而取樣部位在靠近果面1～2 cm的深度，滲透進(jìn)果肉淺表皮的這部分根皮苷剛好處于取樣范圍；因此，在接種0 h時(shí)，處理組的類(lèi)黃酮含量就顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。接菌后，處理組和對(duì)照組PAL活力改變，影響總酚和類(lèi)黃酮的合成過(guò)程，而PPO活力的改變，使總酚和類(lèi)黃酮氧化生成醌類(lèi)物質(zhì)，再經(jīng)過(guò)非酶聚合反應(yīng)生成黑色素[24]的過(guò)程發(fā)生變化，這兩個(gè)酶協(xié)同作用使得總酚和類(lèi)黃酮的積累改變，果實(shí)的抗性能力隨之改善。這與前人研究獼猴桃[25]、柑橘[26]上的誘導(dǎo)抗性反應(yīng)結(jié)果表現(xiàn)一致?？梢?jiàn)，外源激發(fā)子處理能夠有效誘導(dǎo)植物體PAL和PPO活力的改變，調(diào)節(jié)總酚和類(lèi)黃酮合成代謝途徑，從而使植物抗病能力增加。

POD在木質(zhì)素合成中起重要的作用，催化了木質(zhì)素最后一步的合成[27]，并在活性氧代謝中也發(fā)揮了重要作用，可有效消除活性氧對(duì)細(xì)胞膜脂的傷害，減緩細(xì)胞的衰老死亡過(guò)程。侯琿等[28]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)草酸、水楊酸和苯并噻二唑處理后甜瓜體內(nèi)的POD活力上升十分顯著，植物體的抗性增加。本研究發(fā)現(xiàn)，根皮苷處理組POD活力始終保持在一個(gè)較對(duì)照組高的水平，從而促進(jìn)了木質(zhì)素的合成，阻礙病原菌的繼續(xù)入侵，并有效降低了H2O2的積累，減弱了果實(shí)細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度。接種B. cinerea后，根皮苷處理組和對(duì)照組POD活力開(kāi)始上升，促進(jìn)木質(zhì)素的積累，從而抑制病原菌生長(zhǎng)，干擾外多聚半乳糖醛酸的降解，并使侵入的菌絲木質(zhì)化[29]，但對(duì)照組POD活力和木質(zhì)素含量始終低于處理組（P＜0.05）?；钚匝醯漠a(chǎn)生是植物接受逆境信號(hào)的首要表現(xiàn)，可破壞植物細(xì)胞膜以及蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)，造成植物體的不可逆?zhèn)30]。Huan Chen等[31]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)熱激處理的桃果實(shí)中H2O2含量明顯減少，對(duì)果實(shí)細(xì)胞的傷害也降低，果實(shí)的抗性得到改善。本研究發(fā)現(xiàn)，在接種B. cinerea后，H2O2的含量在接種后初期呈直線上升趨勢(shì)，但處理組的H2O2含量低于對(duì)照組，主要是處理組POD活力較對(duì)照高，將H2O2分解的速率較快，膜脂過(guò)氧化程度低于對(duì)照組，果實(shí)細(xì)胞的衰老死亡過(guò)程也較對(duì)照組緩慢。因此認(rèn)為，外源根皮苷處理有效誘導(dǎo)了POD活力的改變，從而促進(jìn)木質(zhì)素的合成積累，增加果實(shí)的物理抗病能力，并減少H2O2的積累，降低了H2O2對(duì)果實(shí)細(xì)胞膜脂的傷害，延緩了果實(shí)細(xì)胞的衰老凋亡過(guò)程，從而改善了果實(shí)的抗病能力。

4 結(jié) 論

根皮苷對(duì)灰霉菌具有直接的抑制作用，1.0 g/L根皮苷可以完全抑制灰霉菌的生長(zhǎng)，同質(zhì)量濃度根皮苷可作為外源激發(fā)子顯著降低果實(shí)的發(fā)病率，抑制果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)大，并有效誘導(dǎo)了抗性相關(guān)酶PAL、POD和PPO活力的變化，從而增加了總酚、類(lèi)黃酮和木質(zhì)素的積累，顯著降低H2O2的含量。通過(guò)這一系列防御酶和防御物質(zhì)的變化，協(xié)同作用于病原菌，從而改善果實(shí)的抗病能力，防預(yù)果實(shí)病害的發(fā)生。