鹽脅迫環(huán)境下接種根際促生細菌對堿蓬根際土壤微環(huán)境特征的影響

井大煒，馬海林，劉方春，杜振宇，賈?；?，馬丙堯，王春麗,郭英華，丁洪星

(1.德州學院資源環(huán)境與規(guī)劃學院，山東 德州 253023；2.山東省林業(yè)科學研究院， 山東 濟南 250014；3.德州學院生態(tài)與園林建筑學院，山東 德州 253023； 4.山東和信德檢測技術有限公司，山東 濟南 250101；5.濟南市國有苗圃， 山東 濟南 250100；6.濟南花木聯(lián)合開發(fā)公司，山東 濟南 250100)

我國為世界鹽堿地大國，鹽漬土面積高達9.91×107hm2，約占國土面積的1.03%[1-2]。鹽漬化土壤不僅對農林業(yè)造成很大的威脅，而且會引起土壤退化，導致土地利用率急劇下降。面對土壤退化、世界人口劇增與淡水匱乏的全球性生態(tài)問題，如何開發(fā)與利用鹽堿地資源已成為農林業(yè)科學研究者關注的重大課題[3-4]。近年來，許多研究者針對鹽堿地改良進行了大量的嘗試，并積累了一定的鹽堿地改良技術[1]。

植物根際促生細菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)指生存在植物根圈微域內，對病原菌有拮抗或對植物生長有促進效應的有益細菌的統(tǒng)稱，對病害防治與植物生長有極其重要的作用[5]。PGPR具有降解土壤中污染物的作用，并減少生產中使用化肥、農藥帶來的環(huán)境污染與土壤板結等問題[6]。有研究發(fā)現(xiàn)[7]，接種產生長素或產羧酸脫氨酶的PGPR，對作物生長有顯著的促進作用。也有研究表明[8]，接種PGPR有利于改善植物根際生態(tài)環(huán)境，并能明顯促進根系生長?？梢?，PGPR的開發(fā)研究正逐漸得到了越來越多的重視，但有關PGPR在鹽脅迫環(huán)境中對根際微環(huán)境特征影響的研究較少。

林木根際是各種養(yǎng)分、水分與各種物質進入根系參與物質循環(huán)和能量轉化的重要場所之一[9]。植物根際土壤微生物有助于增加土壤有機質與總氮含量，并增強植物的抗逆性[10-11]。土壤鹽漬化不僅可以直接影響微生物的活性，還能通過改變土壤的理化性狀影響微生物的生存環(huán)境，進而影響微生物的種類與數(shù)量[12]。因此，近年來諸多學者認為[5,12]，積極改善土壤微生態(tài)環(huán)境，充分協(xié)調根際土壤中微生物的數(shù)量與多樣性，有利于增強植物對逆境脅迫環(huán)境的耐受性。同時，維持土壤微生物多樣性對于提高農林業(yè)生產力、抑制土傳病害與增強土壤緩沖能力具有重要意義[13]。堿蓬(Suaedaglauce)是藜科(Chenopodiaceae)堿蓬屬(Suaeda)植物，可增加土壤中氮、磷、鉀與有機質含量，并能消除裸露鹽堿荒灘，有效防止水土流失，對于保持與重建鹽地生態(tài)具有十分重要的作用[14-15]。為此，本文選取蠟樣芽孢桿菌為供試菌株，以堿蓬為試材，開展不同鹽脅迫梯度下接種PGPR對堿蓬根際土壤微環(huán)境特征的影響研究，旨在明確PGPR對堿蓬耐鹽性的改善效果，為鹽脅迫環(huán)境下PGPR的推廣應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與供試材料

試驗地點選在山東省德州市農業(yè)科學研究院試驗大棚，供試土壤為潮土，土壤堿解氮含量32.87 mg/kg，有效磷含量28.06 mg/kg，速效鉀含量86.50 mg/kg，有機質11.93 g/kg，可溶性鹽分為0.069 5%，pH值 8.06。供試堿蓬為1年生實生苗，株高(12.56±3.92)cm，地徑(0.14±0.02)cm。

利用梯度稀釋法與三區(qū)劃線法從堿蓬的根際土壤中分離并純化出細菌分離物，然后參考Liu等[8]的生物法(小麥葉片保綠和蘿卜子葉增重)篩選出1株促生效果較好的植物根際促生細菌，結合其生理生化特征與16S rRNA基因序列分析，綜合鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)TPR033。將該菌株接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，pH值7.0～7.2)中，于37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2～3 d。然后，接種到液體培養(yǎng)基(乳糖2%，蛋白胨2%，K2HPO40.15%，MgSO4·7H2O 0.02%，CaCl20.01%，pH值6.2～6.8)中，接種量10%，于30～35 ℃搖床培養(yǎng)，轉速180 r/min，培養(yǎng)12 h，利用平板計數(shù)法測定每毫升的含菌數(shù)量，并計算菌液濃度，統(tǒng)一稀釋至2×108CFU/mL。

1.2 試驗設計

盆栽試驗于2016年6月4日開始，選出長勢基本一致的苗木進行盆栽，盆大小規(guī)格為：高20 cm、直徑30 cm。每盆稱土9.8 kg。試驗共設7個處理，分別為：1)CK：對照，不加NaCl和PGPR；2)LS：輕度鹽脅迫，鹽分質量分數(shù)10.0 g/kg；3)MS：中度鹽脅迫，鹽分質量分數(shù)15.0 g/kg；4)SS：重度鹽脅迫，鹽分質量分數(shù)20.0 g/kg；5)LS+P：在處理2的基礎上加入PGPR菌液；6)MS+P：在處理3的基礎上加入PGPR菌液；7)SS+P：在處理4的基礎上加入PGPR菌液。重復5次。處理5、6、7是分別取PGPR菌液10 mL，稀釋至150 mL，均勻澆灌于堿蓬苗根系周圍；然后澆水至75%的田間持水量，每天按時澆水，保持土壤含水量為田間持水量的65%～70%。

1.3 測定項目與方法

在2016年9月30日采用剝落分離法[5]采集根際土，并將所取根際土樣混勻后分成3份：一份新鮮樣品用于微生物數(shù)量和微生物量碳、氮的測定，一份樣品風干后過1 mm篩后用于根系分泌物的分析，另一份放于-80 ℃的冰箱中保存用于微生物多樣性指數(shù)的分析。

根系分泌物中氨基酸總量、有機酸總量與總糖分別采用甲醛滴定法、液相色譜儀法與蒽酮比色法進行測定[16]；土壤微生物數(shù)量采用稀釋平板計數(shù)法，細菌、放線菌或真菌的測定分別采用牛肉蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、改良高氏1號培養(yǎng)基或馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基。土壤微生物量碳、氮的測定采用氯仿熏蒸K2SO4浸提法[16]。土壤微生物群落多樣性采用Biolog GN平板分析法測定[13]。同時，根系體積采用排水法測定；根系總吸收面積、活躍吸收面積采用甲烯藍吸附法[17]測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)與最小顯著差異法(LSD)比較不同處理組間的差異，顯著性水平設定為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 根際土壤中根系分泌物總含量

從表1可見，堿蓬根際土壤根系分泌物中的有機酸總量與氨基酸總量呈現(xiàn)出基本一致的變化規(guī)律。同CK相比，LS處理的有機酸總量、氨基酸總量變化較小，而MS和SS處理則顯著降低了有機酸總量和氨基酸總量；當接種PGPR后，對應的有機酸總量、氨基酸總量均顯著升高，以LS+P處理的有機酸總量、氨基酸總量為最高，并顯著高于其他處理，其中有機酸總量分別較CK、LS、MS、SS、MS+P和SS+P處理提高14.57%、15.36%、39.28%、69.32%、27.38%和42.95%。SS+P處理的有機酸總量、氨基酸總量與MS處理差異不顯著。此外，各個處理的總糖含量并未表現(xiàn)出明顯差異。由此可知，隨土壤鹽分梯度的增加，堿蓬根際土壤根系分泌物中的有機酸總量和氨基酸總量呈遞減的變化趨勢，而接種PGPR能使對應的指標顯著升高。

表1 不同處理對堿蓬根際土壤中根系分泌物總含量的影響

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準差，同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 根際土壤微生物數(shù)量與微生物量碳、氮含量

從表2可見，在鹽脅迫環(huán)境中，堿蓬根際土壤的微生物數(shù)量明顯降低，且微生物數(shù)量隨土壤鹽分梯度的增加而降幅變大。同CK相比，LS、MS和SS處理的細菌數(shù)分別下降8.04%、22.89%和37.78%。當接種PGPR后，各處理對應的細菌數(shù)和放線菌數(shù)顯著增加，而真菌數(shù)變化幅度較小。LS+P處理的細菌數(shù)、放線菌數(shù)和微生物總量均為最高，并顯著高于其他處理，分別較CK顯著高出12.80%、24.77%和15.81%。土壤微生物總量的變化趨勢類似于細菌數(shù)。此外，不同處理的微生物量碳、氮含量表現(xiàn)出相似的變化趨勢，加菌液處理均顯著高于對應的不加菌液處理，其中LS+P處理的微生物量碳、氮含量顯著高于其他處理。上述結果顯示，土壤鹽脅迫易引起堿蓬根際土壤微生物數(shù)量與微生物量碳、氮含量的顯著下降，而接種根際促生細菌可減弱鹽分脅迫的影響，其中輕度鹽脅迫下接種的效果最為顯著。

表2 不同處理對堿蓬根際土壤微生物數(shù)量與微生物量碳、氮含量的影響

2.3 微生物多樣性指數(shù)

從圖1可見，隨土壤鹽分強度的加大，堿蓬根際土壤的微生物多樣性指數(shù)呈遞減趨勢，當接種PGPR后，加菌液處理的微生物多樣性指數(shù)均顯著高于對應的不加菌液處理，其中LS+P處理的微生物多樣性指數(shù)最高，依次為CK、LS、MS和SS處理，且各處理之間的差異均達顯著水平，這與微生物總量的變化規(guī)律一致；而MS+P處理的微生物多樣性指數(shù)與CK差異不顯著，SS+P處理與LS處理無顯著性差異，這與微生物總量的變化規(guī)律不完全一致，其原因可能是中度、重度鹽脅迫使堿蓬的微生物多樣性指數(shù)降低，而添加PGPR則能顯著增加對應的微生物多樣性。表明接種根際促生細菌可以改善根際環(huán)境，并對各類微生物的作用效果有差異，導致土壤中微生物總數(shù)與微生物多樣性指數(shù)的變化趨勢不一致。以上分析認為，輕度鹽脅迫下接種蠟樣芽孢桿菌能顯著提高堿蓬根際土壤的微生物多樣性指數(shù)，且增幅顯著高于其他處理。

圖1 不同處理對堿蓬根際土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

2.4 根系吸收面積

從表3可知，隨土壤鹽分強度的增加，堿蓬的根體積、總吸收面積與活躍吸收面積呈逐漸降低的趨勢，且降幅越來越大。當接種PGPR后，加菌液處理的根體積、總吸收面積與活躍吸收面積均顯著高于對應的不加菌液處理，其中LS+P處理的根體積與CK無顯著性差異，而總吸收面積、活躍吸收面積分別顯著高于CK 8.33%、28.24%；同時，LS+P、MS+P和SS+P處理的根系指標表現(xiàn)出遞減的變化趨勢。從表3還可見，LS+P處理的活躍吸收面積/總吸收面積比值顯著高于其他處理，其次為CK、MS+P和SS處理，而LS、MS和SS+P處理之間差異不顯著。數(shù)據(jù)分析顯示，在不同梯度的鹽脅迫環(huán)境下接種根際促生細菌能不同程度地提高堿蓬根系的總吸收面積與活躍吸收面積，其中在輕度鹽脅迫下接種的效果最明顯，這更利于促進根系對水分、養(yǎng)分的吸收。

表3 不同處理對堿蓬根系總吸收面積與活躍吸收面積的影響

3 小結與討論

林木根際是林木根系-土壤-微生物相互作用的特殊微生態(tài)環(huán)境，根際土壤微生物數(shù)量與種類是表征土壤肥力的重要生物學指標[11,13]。本試驗針對堿蓬設置了10.0、15.0和20.0 g/kg 3個鹽分梯度，結果表明20.0 g/kg鹽分梯度時堿蓬的生長受到了顯著抑制，并出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而李強等[18]關于NaCl脅迫對堿蓬幼苗生長的研究認為，當鹽分含量≥25.0 g/kg時才出現(xiàn)幼苗死亡現(xiàn)象，這與本研究結果不完全一致，可能與堿蓬的種類、土壤性狀和試驗周期等因素的差異有關。本試驗中，鹽脅迫導致堿蓬根際土壤微生物數(shù)量顯著下降，且隨脅迫梯度的增加，降幅越來越大，這與劉磊等[12]鹽脅迫對甜菜根際土壤微生物數(shù)量的研究結果基本一致。表明堿蓬根際土壤中的微生物種群對周圍鹽分濃度的變化較敏感，土壤鹽脅迫使土壤微生物生境發(fā)生了變化，從而使其種群數(shù)量受到了影響[19]。在堿蓬生長過程中，根系在從土壤中吸收養(yǎng)分與水分的同時，亦會向土壤中釋放無機離子、分泌質子或溢泌有機物[11]，即根系分泌物。本研究中，接種PGPR能使對應的微生物數(shù)量顯著提高，究其原因與接種蠟樣芽孢桿菌能促使堿蓬根系分泌物的增多有密切關聯(lián)，這為微生物的快速生長繁殖提供了營養(yǎng)物質與能量來源。其中在輕度脅迫下接種的效果最為顯著，其次為中度或重度脅迫下接種，說明低鹽環(huán)境可能更利于根際促生細菌的定植與繁殖生長。

生物多樣性指數(shù)可在一定程度上表征生物群落中物種的豐富程度與各類型間的分布比例[13]。本試驗中，MS+P處理的微生物多樣性指數(shù)與CK差異不顯著，SS+P處理與LP處理無顯著性差異，這與微生物總量的變化規(guī)律不一致。其原因在于不同處理使堿蓬根際微環(huán)境對各類微生物的影響作用存在差異，可能僅適宜某一類或幾類微生物的生長，而對其他類微生物則并無作用[10]。中度、重度鹽脅迫導致堿蓬的微生物多樣性指數(shù)降低，而接種根際促生細菌則能明顯增加對應的微生物多樣性，進而導致土壤微生物多樣性指數(shù)與微生物總量的變化趨勢不同步。本研究還表明，LS+P處理的微生物多樣性指數(shù)顯著高于其他處理，這與該處理能顯著提高根系分泌物中的有機酸和氨基酸含量有關，進一步印證了蠟樣芽孢桿菌在輕度鹽脅迫下更利于快速繁殖，其作用效果顯著優(yōu)于中度或重度鹽脅迫。

當植物受到鹽脅迫時，根系首先感應到根際土壤的變化。植物根系是活躍的吸收器官與合成器官，根系吸收面積可反映根系吸收水分與養(yǎng)分的能力，而根系活躍吸收面積則可表征根系活力的狀況[17]。本試驗中，鹽脅迫導致堿蓬根系的總吸收面積與活躍吸收面積顯著降低，而接種PGPR使對應的根系總吸收面積與活躍吸收面積顯著升高。這是由于該促生細菌顯著增強了堿蓬的根系活性，同時還能明顯改善土壤微生態(tài)環(huán)境條件[7]，從而為根系生長創(chuàng)造了優(yōu)越的環(huán)境條件。同時發(fā)現(xiàn)，LS+P處理的根系總吸收面積與活躍吸收面積顯著高于其他處理，這是因為蠟樣芽孢桿菌在輕度鹽脅迫下對堿蓬根系活性的刺激作用明顯強于中度、重度鹽脅迫。這對于增強堿蓬根系對養(yǎng)分、水分的吸收能力，進而提高堿蓬的耐鹽性具有重要指導意義，也為進一步促進堿蓬在鹽脅迫生境下的生長提供了新思路。