泥鰍蛋白抗氧化肽的Plastein反應(yīng)修飾研究

高丹丹，程 浩，馬忠仁，2，田曉靜，李明生，2，陳士恩，常坤朋，劉根娣，*，娜扎瑞爾·亞哈亞

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124； 2.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030； 3.馬來(lái)西亞伊斯蘭理科大學(xué) 理工學(xué)院，馬來(lái)西亞 森美蘭州 尼來(lái)新區(qū) 71800)

自由基是一類可以單獨(dú)存在于生物體中的含有一個(gè)或幾個(gè)未配對(duì)電子的原子或原子團(tuán)，其氧化活性極高，具有非?；钴S的化學(xué)性質(zhì)[1]。過(guò)多的自由基會(huì)破壞機(jī)體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，從而引起如心腦血管病、關(guān)節(jié)炎、腫瘤、老年性白內(nèi)障、肝病、肺病、擴(kuò)張性心肌病、衰老等各種疾病[2]?？寡趸木哂星宄杂苫墓δ埽軌蛞种苹蛳趸磻?yīng)，利用抗氧化肽作為自由基清除劑來(lái)預(yù)防和治療自由基誘發(fā)的疾病具有廣闊的發(fā)展前景[3]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大多采用蛋白酶直接將原料蛋白質(zhì)水解的方法來(lái)制備抗氧化肽，研究重點(diǎn)主要集中在不同底物蛋白質(zhì)、水解酶的選擇以及酶解條件的優(yōu)化等方面[4-7]。然而，原料蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)必定會(huì)限制和影響酶解法制備得到的抗氧化肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)和抗氧化活性，為了打破這種限制，有效提高抗氧化肽的抗氧化活性，可以對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾處理。

Plastein反應(yīng)又稱類蛋白反應(yīng)，是Danilevski和Okuneff于1902年發(fā)現(xiàn)的。Plastein反應(yīng)一般被認(rèn)為是蛋白酶存在下蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的逆反應(yīng)，通常分為水解、濃縮和合成三步進(jìn)行[8]，是指在一定條件下，蛋白酶催化高濃度的蛋白質(zhì)水解物或低聚肽混合物，生成沉淀、觸變膠體或具觸變性黏稠的膠狀類蛋白產(chǎn)物的過(guò)程[9]。該反應(yīng)的機(jī)理較為復(fù)雜，可能涉及水解反應(yīng)、濃縮作用、轉(zhuǎn)肽作用、物理聚集中的一種或幾種[10]。Plastein反應(yīng)能夠產(chǎn)生原料蛋白質(zhì)所沒(méi)有的新肽段，其產(chǎn)物具有與原料蛋白質(zhì)不同的氨基酸序列，所以Plastein反應(yīng)可以去除蛋白質(zhì)水解物的苦味，改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，已成為食品工業(yè)研究的熱點(diǎn)[11]。研究表明，Plastein反應(yīng)修飾可以顯著提高某些動(dòng)植物蛋白源抗氧化肽的抗氧化活性。張強(qiáng)等[12]研究發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇源抗氧化肽修飾產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力大概是修飾前的4倍。王晗欣等[13]研究發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆蛋白抗氧化肽修飾產(chǎn)物的還原力和羥自由基清除率都有顯著提高。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)Plastein反應(yīng)修飾可以提高大豆蛋白的抗氧化活性，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化修飾反應(yīng)的工藝條件。但Plastein反應(yīng)用于改善泥鰍蛋白源抗氧化肽的活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以泥鰍為原料提取泥鰍蛋白，采用中性蛋白酶水解泥鰍蛋白制備抗氧化肽，采用木瓜蛋白酶對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽進(jìn)行Plastein反應(yīng)修飾，以期提高泥鰍蛋白抗氧化肽的抗氧化活性，為天然高效抗氧化劑的制備提供一種新途徑，為泥鰍資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

泥鰍購(gòu)于甘肅省蘭州市城關(guān)區(qū)綠色市場(chǎng)；木瓜蛋白酶(107 145 U·g-1)購(gòu)于中生瑞泰科技有限公司；DPPH自由基購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、組氨酸、纈氨酸上海中泰化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰苯二甲醛、無(wú)水乙醇、十二烷基硫酸鈉、硼酸、硼砂、β-巰基乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

JA2003N型電子天平，上海天平儀器廠；PB-10型便攜式臺(tái)式酸度計(jì)，北京格拉威爾公司；UV2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，龍泥柯儀器有限公司；JJ-2組織搗碎機(jī)，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；WS28型電熱恒溫水浴鍋，西安禾普生物科技有限公司；TCL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；直立臺(tái)式凍干機(jī)，美國(guó)熱電公司。

1.2 方法

1.2.1 泥鰍蛋白抗氧化肽的制備

鮮活泥鰍→預(yù)處理→搗碎成肉泥→5%(m/V)懸浮液→熱變性處理(90 ℃水浴15 min)→冷卻至室溫→調(diào)節(jié)pH至7.0→中性蛋白酶水解(E/S為3 200 U·g-1，溫度25 ℃，時(shí)間4 h)→加熱滅酶(90 ℃水浴15 min)→調(diào)節(jié)pH至4.6→離心(5 000 r·min-1，20 min)→收集中間清液→真空冷凍干燥→泥鰍蛋白抗氧化肽。

1.2.2 游離氨基含量的測(cè)定

采用鄰苯二甲醛(OPA)法[15]。

1.2.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

吸取1 mL樣品溶液于比色管中，加入0.2 mL 0.4 mol·L-1DPPH自由基溶液(無(wú)水乙醇配制)，再加入2.0 mL蒸餾水，混勻反應(yīng)體系，室溫下置于黑暗中反應(yīng)30 min后于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值；以等體積無(wú)水乙醇代替DPPH自由基溶液作樣品干擾實(shí)驗(yàn)；以等體積蒸餾水代替樣品溶液作樣品對(duì)照試驗(yàn)，計(jì)算DPPH自由基的清除率[16]。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取一定量的泥鰍蛋白抗氧化肽于試劑瓶中，用蒸餾水配制成底物濃度為40%的懸浮液，研究不同的外源氨基酸種類(按0.5 mmol·g-1的比例分別加入甘氨酸、亮氨酸、酪氨酸、組氨酸、纈氨酸)、外源氨基酸的比例(分別為0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mmol·g-1)、酶與底物濃度比E/S(800、1 600、2 400、3 200和4 000 U·g-1)、反應(yīng)溫度(25、35、45、55和65 ℃)、反應(yīng)pH值(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)和反應(yīng)時(shí)間(2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 h)對(duì)Plastein反應(yīng)產(chǎn)物游離氨基酸減少量和DPPH自由基清除率的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)，選擇對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)修飾中具有顯著影響的三個(gè)因素：pH值(A)、時(shí)間(B)和加酶量(C)，采用三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design and variables levels for Box-Behnken

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用F檢驗(yàn)對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義，數(shù)據(jù)分析軟件采用Design Expert 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 外源氨基酸的篩選

DPPH自由基清除率測(cè)定是一種常見(jiàn)的有效評(píng)價(jià)活性物質(zhì)抗氧化能力的方法，其分子結(jié)構(gòu)中有未成對(duì)的電子存在，性質(zhì)穩(wěn)定，在波長(zhǎng)517 nm處有最大的吸收值，其吸收值會(huì)隨著其他自由基電子與它本身未成對(duì)電子的配對(duì)而降低，且二者呈定量關(guān)系。在它與抗自由基活性物質(zhì)相互作用時(shí)，它的吸收值降低得越多，則說(shuō)明抗自由基活性物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)[15]。游離氨基減少量則通常作為評(píng)價(jià)Plastein反應(yīng)進(jìn)行程度的指標(biāo)，其數(shù)值越大，表明修飾程度越大，反之則修飾程度越小。由圖1可知，加入5種外源氨基酸之后，泥鰍蛋白抗氧化肽的修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基均表現(xiàn)出一定的清除活性。其中在加入組氨酸的情況下，修飾產(chǎn)物的DPPH自由基清除率最高，達(dá)到了(46.98±0.78)%，加入其他4種氨基酸所得的修飾產(chǎn)物與空白對(duì)照(39.16±0.73)%相比，DPPH自由基清除能力都有所提高，說(shuō)明采用Plastein反應(yīng)修飾可以提高產(chǎn)物的活性。在加入組氨酸的情況下，體系中游離氨基減少量最多，說(shuō)明組氨酸對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽的修飾程度最大，而該修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率最高，因此選用組氨酸作為最佳的外源氨基酸。

圖1 外源氨基酸種類對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of extrinsic amino acid on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

2.1.2 外源氨基酸的比例對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)的影響

由圖2可知，外源氨基酸的添加量也是影響Plastein反應(yīng)的重要因素之一。隨著外源組氨酸添加量的增多，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力先增大后減小，反應(yīng)體系中的游離氨基減少量除在外源組氨酸添加比例0.4 mmol·g-1時(shí)稍有降低外，整體呈現(xiàn)出先增多后減少的變化趨勢(shì)。當(dāng)外源加入組氨酸的比例為0.5 mmol·g-1時(shí)，修飾效果最好，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率也達(dá)到最大值(60.11±1.66)%；加入外源組氨酸比例低于0.5 mol·L-1時(shí)，由于外源氨基酸添加量不足，造成修飾程度不足，影響修飾效果；外源組氨酸加入比例高于0.5 mmol·g-1時(shí)，則可能造成外源氨基酸過(guò)剩，同樣會(huì)使修飾產(chǎn)物的抗氧化活性降低。因此，選擇0.5 mmol·g-1為最佳外源氨基酸添加比例。

2.1.3 酶與底物濃度比(E/S)對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)的影響

由圖3可知，隨著木瓜蛋白酶添加量的增多，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，酶與底物濃度比為1 600 U·g-1時(shí)，其抗氧化活性最高，對(duì)自由基的清除率最大，達(dá)到了(59.04±0.86)%。反應(yīng)體系中游離氨基減少量的變化則沒(méi)有規(guī)律，總體呈現(xiàn)出先增大后減小的變化趨勢(shì)，加酶量2 400 U·g-1時(shí)，游離氨基酸減少量最多為(356.32±9.21) μmol·g-1，Plastein修飾程度最大，但此時(shí)修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率僅有(49.29±1.73)%。由此可以看出，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率和反應(yīng)體系中游離氨基酸減少量并非總是能同步達(dá)到最大值。考慮到提高抗氧化活性和節(jié)約成本，選擇木瓜蛋白E/S為1 600 U·g-1作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖3 加酶量對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of neutrase dose on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

2.1.4 溫度對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)的影響

由圖4可知，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率和游離氨基的減少量都呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)。反應(yīng)溫度為35 ℃時(shí)，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到了(58.69±0.88)%，低于或高于此溫度，其抗氧化活性都有不同程度的降低。而游離氨基酸的減少量在溫度為45 ℃時(shí)達(dá)到最大，為(342.05±2.12)μmol·g-1。蛋白酶的活性受反應(yīng)溫度影響較大，每種酶都有各自的最適反應(yīng)溫度，溫度偏低或偏高，都會(huì)對(duì)蛋白酶的活性產(chǎn)生一定的抑制作用，從而影響Plastein反應(yīng)的效果。因此，選擇35 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

圖4 溫度對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of temperature on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

2.1.5 pH值對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)的影響

由圖5可知，隨著pH值的增加，泥鰍蛋白抗氧化肽的修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力先增大后減小，反應(yīng)體系中游離氨基減少量則呈現(xiàn)出先增大再減少的變化趨勢(shì)。pH值小于6時(shí)，修飾產(chǎn)物對(duì)自由基的清除率均小于40%，這可能是因?yàn)樗嵝原h(huán)境抑制了中性蛋白酶的活性，pH值為8時(shí)，其對(duì)自由基的清除率最大，達(dá)到了(68.92±0.88)%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，且此時(shí)反應(yīng)體系中游離氨基減少量達(dá)到了最大值，Plastein修飾程度最高。因此，選擇pH值8作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.1.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)的影響

由圖6可知，隨著Plastein反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，泥鰍蛋白抗氧化肽的修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率先增大后減小，反應(yīng)體系中游離氨基減少量則呈現(xiàn)出先升高后降低的變化。反應(yīng)時(shí)間2～5 h，游離氨基減少量逐漸增大，修飾程度隨之提高，產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率增加，并在4 h時(shí)達(dá)到最大值(57.35±0.94)%。反應(yīng)5 h時(shí)，體系中游離氨基減少量達(dá)到最大值(346.24±2.88)μmol·g-1，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，游離氨基酸的減少量變小，說(shuō)明游離氨基酸含量增加，這可能是因?yàn)樾揎棶a(chǎn)物在中性蛋白酶的作用下又發(fā)生了水解反應(yīng)，重新生成了相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽類物質(zhì)，修飾程度降低。因此本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間4 h作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖5 pH值對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of pH on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

2.2 泥鰍蛋白抗氧化肽的Plastein反應(yīng)修飾響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

2.2.1 多元二次方程模型的建立與檢驗(yàn)

泥鰍蛋白抗氧化肽的Plastein反應(yīng)修飾的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)選擇3個(gè)對(duì)修飾產(chǎn)物DPPH自由基清除率影響較顯著的三個(gè)因素：pH(A)、時(shí)間(B)和E/S(C)，根據(jù)Box-Beknhen 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了17組處理，其中包括5組中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)修飾產(chǎn)物DPPH自由基清除率的回歸方程為：

Y=54.87+5.47A-7.75B-2.53C-0.74AB+6.31AC-2.30BC-2.11A2+10.60B2-13.18C2。

圖6 時(shí)間對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of time on Plastein reaction of antioxidant peptide from loach protein

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and the experimental result

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

*表示在5%的水平內(nèi)顯著(P<0.05)；**表示在1%的水平內(nèi)顯著(P<0.01)。
* showed the significance within the 5% level (P<0.05); ** showed significance within the 1% level (P<0.01).

該回歸方程的回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表4所示。從表4數(shù)據(jù)可以看出，一次項(xiàng)A(P<0.01)和B(P<0.01)，二次項(xiàng)B2(P<0.01)和C2(P<0.01)在1%水平內(nèi)顯著，一次項(xiàng)C(P<0.05)在5%水平內(nèi)顯著，表明在泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)修飾過(guò)程中，pH值、時(shí)間和E/S這三個(gè)因素對(duì)修飾產(chǎn)物DPPH自由基清除率都有顯著影響。交互項(xiàng)AC(P<0.05)在5%水平內(nèi)顯著，表明pH值和加酶量?jī)梢蛩氐慕换プ饔脤?duì)修飾產(chǎn)物DPPH自由基清除率有顯著的影響。

2.2.2 響應(yīng)面分析和優(yōu)化

通過(guò)上述響應(yīng)面二次多項(xiàng)回歸模型方程的建立，得出如圖7所示的響應(yīng)面的曲面圖。通過(guò)該組動(dòng)態(tài)圖可以對(duì)任意兩個(gè)因素交互作用影響修飾產(chǎn)物DPPH自由基清除率效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)與分析，并可以從中確定最佳因素的水平范圍。交互作用影響效應(yīng)的強(qiáng)弱和大小可以通過(guò)等高線的形狀反映出來(lái)，其形狀越接近橢圓，表示兩種因素的交互作用影響越顯著，反之越接近圓形，則表明兩種因素的交互作用影響越不顯著[17]。

圖7 pH值、時(shí)間和加酶量交互作用影響修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的曲面圖Fig.7 Response surface plot for the effects of scavenging capacity on DPPH free radical of modified antioxidant peptide by Plastein reaction pH， time and neutrase dose

圖7-A表示了pH值和反應(yīng)時(shí)間修飾產(chǎn)物DPPH自由基清除率的交互作用的影響效應(yīng)。由其等高線圖可以看出pH值和時(shí)間的交互作用影響不顯著。當(dāng)把加酶量固定在0水平時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率先減小后增大。隨著反應(yīng)pH值的升高，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)出增大趨勢(shì)。pH值9.0，反應(yīng)時(shí)間3 h，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值79.45%。由圖7-A也可以看出反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的曲線比較陡峭，說(shuō)明在反應(yīng)過(guò)程中時(shí)間對(duì)修飾產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響大于pH值。

圖7-B表示了pH值和加酶量對(duì)修飾產(chǎn)物DPPH自由基清除率的交互作用的影響效應(yīng)。由其等高線可以看出pH值和加酶量的交互作用影響顯著。當(dāng)把反應(yīng)時(shí)間固定在0水平時(shí)，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率隨著pH值的升高而增大。隨著加酶量的增多，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率先增大后減小，加酶量1 600 U·g-1時(shí)，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值，隨著加酶量的繼續(xù)增多，則有所減小，可能是由于過(guò)量的蛋白酶會(huì)引發(fā)修飾產(chǎn)物發(fā)生二次水解，使體系中抗氧化活性物質(zhì)的數(shù)量有所減少，從而影響修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率。pH值8.0，加酶量1 600 U·g-1時(shí)，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值58.56%。

圖7-C表示了反應(yīng)時(shí)間和加酶量對(duì)修飾產(chǎn)物DPPH自由基清除率的交互作用的影響效應(yīng)。由其等高線可以看出反應(yīng)時(shí)間和加酶量的交互作用影響不顯著。當(dāng)把pH值固定在0水平時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率先降低后升高。隨著加酶量的增多，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。反應(yīng)時(shí)間3 h，加酶量1 600 U·g-1時(shí)，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值73.22%。

2.2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，并利用 Design Expert 8.0軟件，獲得本實(shí)驗(yàn)修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率最高時(shí)的各因素的最佳反應(yīng)條件為pH值9.0、反應(yīng)時(shí)間3 h、E/S為1 782.49 U·g-1，在此反應(yīng)條件下，修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率為78.03%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的可信度，在此最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率分別為77.98%、77.91%和78.07%，平均值為(77.98±0.08)%，該實(shí)測(cè)值與理論值的誤差小于±1%，由此可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際的泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)修飾的情況。

3 結(jié)論

采用中性蛋白酶水解泥鰍蛋白制備抗氧化肽，用木瓜蛋白酶對(duì)其進(jìn)行Plastein反應(yīng)修飾，以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)評(píng)價(jià)其抗氧化活性，以游離氨基酸的減少量作為Plastein反應(yīng)程度的指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了氨基酸種類、外源氨基酸添加量、E/S、pH值、溫度和時(shí)間對(duì)泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)修飾的影響，并在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化了泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)修飾工藝，得到泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)修飾的最佳工藝為：以木瓜蛋白酶催化泥鰍蛋白抗氧化肽與組氨酸反應(yīng)，反應(yīng)體系pH值9.0、時(shí)間3 h、加酶量1 782.49 U·g-1、底物濃度40%、溫度35 ℃、外源氨基酸比例0.5 mmol·g-1，在此反應(yīng)條件下測(cè)得泥鰍蛋白抗氧化肽Plastein反應(yīng)修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到(77.98±0.08)%，是修飾前的1.99倍，與響應(yīng)面模型優(yōu)化后得到的預(yù)測(cè)結(jié)果較吻合。本研究通過(guò)Plastein反應(yīng)修飾的方法有效提高了泥鰍蛋白抗氧化肽的抗氧化活性，為其作為天然高效抗氧化劑方面的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，并為泥鰍資源的綜合利用提供新途徑。