腎虛血瘀型卵巢早衰模型大鼠的建立

黃葉芳 李宛靜 鄧蒂斯 張純

（1成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 四川 成都 610000）

（2成都中醫(yī)藥大學 四川 成都 610000）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指婦女40歲前出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)性閉經(jīng)，表現(xiàn)為高水平的促性腺激素（卵泡刺激素、黃體生成素）和低水平的雌激素，患者長期的低雌激素水平增加不孕、骨質(zhì)疏松癥、冠心病和抑郁癥的風險，并可能導致神經(jīng)系統(tǒng)疾病和認知功能受損[1]。卵巢早衰在臨床上治療難度大，并且其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2]。祖國醫(yī)學中并無“卵巢早衰”的病名，而是根據(jù)其不同的臨床表現(xiàn)可歸納為中醫(yī)學中的“月經(jīng)先期”“月經(jīng)后期”“月經(jīng)先后不定期”“月經(jīng)過少”“崩漏”“全不產(chǎn)”“斷續(xù)”“絕經(jīng)前后諸證”等。目前文獻報道中所構(gòu)建的卵巢早衰模型僅僅是疾病模型，未能結(jié)合證型，對中醫(yī)藥研究上仍是有所缺陷。故本研究建立腎虛血瘀型POF動物模型，為中醫(yī)藥辨證治療腎虛血瘀型卵巢早衰提供研究基礎[3]。

1.材料與方法

1.1 實驗動物

SD雌性大鼠，SPF級，10-12周齡，健康，四川省中醫(yī)藥科學院提供，動物許可證SYXK(川)2013-100，隔日換墊料，自由飲食飲水，均喂養(yǎng)標準大鼠顆粒飼料，室溫控制在22～25℃，濕度70%，通風良好。入組標準：動物購入后適應性喂養(yǎng)2～3天，連續(xù)5～10天做陰道涂片，動情周期正常的大鼠納入。

1.2 儀器與試劑

放免計數(shù)分析儀GC1200（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；酶標分析儀KC-100（深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司）；自動血流變測試儀SA-9000（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）。雌二醇（E2）放射免疫分析藥盒（天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司）；大鼠抗繆勒管激素（AMH）ELISA試劑盒（BIOVALUE公司）；雷公藤多甙片（10mg/片，湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）。

1.3 模型的建立與分組

將有動情周期的48只大鼠隨機分為空白組、疾病模型組和病癥結(jié)合模型組A、病癥結(jié)合模型組B，每組12只。

（1）空白組：灌服生理鹽水2ml/100g，1次/d，標準大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，共28天。

（2）疾病模型組：生理鹽水配制的雷公藤多甙片懸浮液灌胃，50mg?（kg?d）-1，標準大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，共28天。

（3）病證結(jié)合模型組A：給藥方法同疾病模型組，同時對大鼠施加冰浴，連續(xù)28日。冰浴方法如下：每天將大鼠放置于0至1攝氏度冰水中浸泡（浸泡部位至腹部即可），浸泡時間為20分鐘/天，連續(xù)進行28天。

（4）病證結(jié)合模型組B：生理鹽水配制的雷公藤多甙片懸浮液灌胃，50mg?kg-1?d-1，同時對大鼠施加驚恐和高脂飲食，連續(xù)28日。施加驚恐和高脂飲食方法如下：（1）驚恐：采用貓嚇鼠法(即恐傷腎)建立腎虛模型，將該組大鼠放入特制的小鐵絲籠內(nèi)，此小籠固定在裝有一只大公貓的大籠中，貓可在內(nèi)自由活動，該貓兇狠善捕鼠。貓與鼠僅一網(wǎng)之隔， 貓爪可以觸及鼠。每天上、下午各恐嚇2h，即9:00～11:00，15:00～17:00，期間每隔20min刺激貓一次，使其發(fā)出叫聲。（2）高脂高糖飲食：高脂高糖飼料40克（配方為：豬油15%、白糖8%、膽酸鈉1%、膽固醇5%、丙基硫氧嘧啶0.2%、基礎飼料71.8%）喂養(yǎng)大鼠。

1.4 標本處理及血清性激素的測定

每組大鼠于造模結(jié)束后24h分別取材，麻醉后股動脈取血，處死，留取子宮和卵巢標本用濾紙吸干后，稱其濕重，在AAF固定液中固定48h，做病理切片。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般觀察 在隨機分組后，觀察各組大鼠給藥前被毛、皮膚、糞便、肌肉張力、步態(tài)、精神、呼吸和進食、舌體、唇周顏色等情況，給藥結(jié)束后再次觀察上述指標，進行對比分析。

1.5.2 造模后大鼠血清E2、AMH水平的測定：每組大鼠于造模結(jié)束后24h分別取材，麻醉后股動脈取血，置于EP管內(nèi)離心后檢測（另留取3ml用于血流變指標測定），采用放射免疫分析法測定血中雌二醇（E2）含量，ELISA法測定抗繆勒管激素（AMH），操作規(guī)程按試劑盒說明書進行。

1.5.3 血液流變學指標檢測 取血后留取3ml至肝素鈉抗凝管內(nèi)，檢測全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積、紅細胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原、紅細胞變形指數(shù)等指標。

1.6 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）進行描述。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行比較，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 一般情況觀察

空白組大鼠一般狀態(tài)良好，毛色光滑，反應靈活，大便成形，納食正常，大便正常，舌質(zhì)紅潤。與空白組比較，疾病模型組大鼠出現(xiàn)被毛稍粗糙，毛色無華，蜷縮少動，反應較為遲鈍，納食減少，大便偏稀，舌質(zhì)偏暗等，病癥結(jié)合模型A、B組除出現(xiàn)疾病模型組表現(xiàn)外，還兼見尾部自尖至根出現(xiàn)不同程度瘀青，部分便溏，舌質(zhì)瘀紫等。

2.2 造模后四組大鼠血清E2和AMH水平的變化（見表1）。

疾病模型組、病證結(jié)合模型組A和B組與空白組相比，均出現(xiàn)E2和AMH水平下降（P＜0.05），有統(tǒng)計學意義。該三組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1

2.3 造模后四組大鼠血液流變學指標的變化（見表2）。

病證結(jié)合模型組A和B組與空白組及疾病模型組相比，均出現(xiàn)血漿粘度升高（P＜0.05），其中病證結(jié)合模型組B組較A組升高明顯（P＜0.05）；四組間紅細胞聚集指數(shù)變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；全血低切還原粘度及高切還原粘度比較中，病證結(jié)合模型組A和B組均較空白組及疾病模型組升高（P＜0.05），A組與B組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2

3.討論

本研究結(jié)果顯示，兩種方案制備的大鼠模型，激素測定顯示E2、AMH下降，符合卵巢早衰變化，同時具備腎虛血瘀的中醫(yī)體征，血液流變學中血液粘度、全血低切還原粘度及全血高切還原粘度均上升（P＜0.05），提示血液處于高凝狀態(tài)，其中B組在血液粘度改變上優(yōu)于A組（P＜0.05）。綜上所述，雷公藤多苷片懸浮液灌胃，50mg?（kg?d）-1結(jié)合“冰浴法”，或“貓嚇鼠”加高脂飲食造模28天，可成功建立腎虛血瘀型卵巢早衰大鼠模型；“貓嚇鼠”加高脂飲食法在血漿粘度改變上優(yōu)于“冰浴法”。