樺褐孔菌子實體多酚的抗氧化活性

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(浙江理工大學(xué)理學(xué)院，杭州 310018)

0 引 言

樺褐孔菌[Inontusobliquus(Fr.) Pilat]是一種藥用真菌，屬于白腐真菌，廣泛分布在北美、歐洲和亞洲的北緯45°～50°地區(qū)[1]。在俄羅斯和西伯利亞西部，該真菌主要生長在樺樹的樹干上，能夠引起木材的白化腐朽，被稱作是白腐真菌[1-3]。樺褐孔菌用于民間醫(yī)學(xué)達(dá)四個多世紀(jì)，用來預(yù)防和治療心、肝、胃的疾病以及各種疑難雜癥[4-5]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗材料

用于實驗研究的樺褐孔菌子實體購于杭州市胡慶余堂。

1.1.2 實驗試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、水溶性維生素E(Trolox)、三吡啶基三嗪(TPTZ)、沒食子酸、蘆丁和福林酚等實驗試劑均購于杭州米克試劑公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樺褐孔菌子實體多酚的提取

將樺褐孔菌子實體用烘箱烘干至恒重，用研缽將其顆粒充分研碎，取1.0 g將其盛入離心管中，加入7.0 mL體積的甲醇溶劑，并利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)來進(jìn)行破壁提取，將破碎后的勻漿液在恒溫水浴鍋中60 ℃下靜置6 h，萃取3次，通過高速離心機(jī)離心得到含有多酚的上清液；將所得的上清液旋干，加入去離子水得到水溶液，先采用有機(jī)溶劑氯仿來進(jìn)行萃取，之后再依次用乙酸乙酯和正丁醇對水層進(jìn)行萃取，最后將萃取得到的乙酸乙酯層和正丁醇層萃取液真空旋干，獲得樺褐孔菌子實體的乙酸乙酯層多酚和正丁醇層多酚。

1.2.2 子實體多酚的柱色譜分離

稱取25.0 g葡聚糖凝膠Sephadex LH-20干粉粉末，并溶解于蒸餾水中，間隔30 min就攪拌一次使其溶脹，充分過夜溶脹之后將其填充在柱色譜玻璃柱中，蒸餾水沖洗2～3個柱體積使柱子壓實。濕法上樣后，通過不同比例的甲醇水溶液按照極性由大到小的順序以1滴/s的速度洗脫，每個試管接5.0 mL洗脫液，并且按順序?qū)⒃嚬軜?biāo)號。在280 nm波長下，用紫外分光光度計測定每個試管中洗脫液的吸光度值，根據(jù)測得的每個小試管中洗脫液的吸光度值，繪制吸光度值與小試管編號的變化曲線。根據(jù)曲線，將同一個峰的小試管洗脫液合并成一個組分，將每一個組分旋干后定容到10.0 mL，分析每一個組分的多酚、黃酮含量及抗氧化活性具體方法見文獻(xiàn)[15]。

1.2.3 子實體多酚、黃酮含量的測定

a) 多酚含量的測定

采用福林-酚法來測定各個組分的多酚含量，具體方法見文獻(xiàn)[16]。將經(jīng)過提取純化后的樺褐孔菌子實體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分定容到10.0 mL，用福林-酚法測定波長為765 nm下的OD值，根據(jù)福林-酚法測得的多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出每個組分多酚的含量。

b) 黃酮含量的測定

黃酮含量的測定采用氯化鋁顯色法，具體方法見文獻(xiàn)[17]。將經(jīng)過提取純化后的樺褐孔菌子實體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分定容到10.0 mL，吸取1.0 mL，加入2.0 mL濃度為0.1 mol/L 氯化鋁試劑，加入3.0 mL 濃度為1.0 mol/L 的醋酸鈉試劑，以溶劑(V乙醇∶V水=3∶2)將體積補(bǔ)至10.0 mL，搖勻。在420 nm處測OD值。根據(jù)黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出每個組分的黃酮含量。

1.2.4 子實體多酚DPPH的IC50值的測定

首先配置(0.4 mmol/L)的DPPH甲醇溶液，然后在10.0 mL試管中加入0.8 mL DPPH甲醇溶液，在加入2.4 mL的多酚樣品，將兩者充分混合后放置在暗室中，在室溫下保持30 min。在波長為517 nm下，測得A1值,具體方法見文獻(xiàn)[18]。將多酚樣品換成蒸餾水作為對照組，在相同的波長下測得A0值。將DPPH甲醇溶液換成甲醇溶液，其它條件與前面相同，在同樣的波長下測其A2值。DPPH自由基清除率X計算公式如下：

式中：A0為0.8 mL DPPH甲醇和2.4 mL蒸餾水混合溶液的吸光度；A1為 0.8 mL DPPH甲醇和2.4 mL多酚混合樣品的吸光度；A2為 0.8 mL甲醇和2.4 mL多酚混合樣品的吸光度。

將樺褐孔菌子實體乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分離的每一個組分分別測量五個濃度梯度(2.0～10.0 mg)，求得每一個組分的DPPH的IC50值，并經(jīng)過SPSS軟件分析所得數(shù)據(jù)，計算出樺褐孔菌子實體乙酸乙酯層和正丁醇層不同組分多酚的IC50值。

1.2.5 子實體多酚TEAC法抗氧化活性的測定

TEAC抗氧化活性實驗是參考參考文獻(xiàn)[19]，具體方法為：將5.0 mL的7.0 mmol/L ABTS(2,2-聯(lián)氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二銨鹽))和88 μL的140.0 mmol/L過硫酸鉀混勻,在避光條件下將其置于恒溫水浴鍋中，在30 ℃下靜置過夜，獲得ABTS·+儲備液。配制20.0 mmol/L pH值為4.5的醋酸鈉緩沖液，通過醋酸鈉緩沖液將ABTS·+儲備液進(jìn)行稀釋，直到將儲備液稀釋到在734 nm波長下的吸光度在0.70±0.02這個范圍里時為止，ABTS·+工作液。吸取柱色譜分段組分30.0 μL和3.0 mL的ABTS·+工作液充分混合10 s，將其在30 ℃水浴下靜置6 min，以醋酸鈉緩沖液作為對照，在734 nm波長下測量吸光度值。采用同樣的方法測定Trolox不同濃度下吸光度值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將子實體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分都稀釋成五個不同的濃度(與DPPH實驗濃度梯度相同)，在各個多酚濃度下按照上述方法進(jìn)行實驗，得到每一個組分不同多酚濃度下的吸光值，繪制每一個組分多酚濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)TEAC法Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到每一個組分的TEAC值。

1.2.6 子實體多酚FRAP法抗氧化活性的測定

鐵還原/總抗氧化能力測定(FRAP法)按照參考文獻(xiàn)[19]。首先制備20.0 mmol/L三氯化鐵溶液、10.0 mmol/L三吡啶基三嗪(TPTZ)鹽酸溶液和300.0 mmol/L pH值為3.6的醋酸鹽緩沖液。吸取上述制備好的三氯化鐵溶液和三吡啶基三嗪(TPTZ)鹽酸溶液各2.5 mL與25.0 mL醋酸鹽緩沖液充分混合，然后再取該混合溶液1.8 mL，在37 ℃水浴條件下，分別加入180.0 μL蒸餾水和60.0 μL柱色譜分段提取液，待其反應(yīng)30 min后，以60.0 μL的甲醇作為對照，在593 nm的波長下測量其紫外吸光值。采用同樣的方法測定Trolox不同濃度下吸光度值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，提取液抗氧化活性結(jié)果表示成FRAP值的形式，即每克多酚的含量相當(dāng)于Trolox物質(zhì)的摩爾數(shù)。將子實體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分都稀釋成五個不同的濃度(與DPPH實驗濃度梯度相同)，在各個多酚濃度下按照上述方法進(jìn)行實驗，得到每一個組分不同多酚濃度下的吸光值，進(jìn)而建立每一個組分多酚濃度與吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所建立的FRAP法Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到每一個組分的FRAP值。

2 結(jié)果與討論

2.1 子實體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜流出曲線分析

用葡聚糖凝膠柱色譜分離的方法，不同比例的水和甲醇為洗脫劑對樺褐孔菌子實體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層組分進(jìn)行分離，根據(jù)洗脫液在280 nm下吸光度不同，將洗脫物合并為不同的分段組分，所制得乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜流出曲線如圖1所示。樺褐孔菌子實體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層根據(jù)流出曲線均是獲得5個組分，由于乙酸乙酯層多酚和正丁醇層多酚的極性不同，所以柱色譜流出曲線也是不同的，在乙酸乙酯層多酚柱色譜分段組分中SF3中有著最高的吸光度，而在正丁醇層多酚柱色譜分段組分中SF1有著最高的吸光度。

圖1 樺褐孔菌子實體中的多酚柱色譜流出曲線

注：SF1～SF5是指柱色譜分離的第一到第五組分

2.2 子實體萃取物柱色譜分段組分多酚和黃酮含量

采用葡聚糖凝膠柱色譜分離的方法，不同比例的水和甲醇為洗脫劑對樺褐孔菌子實體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層組分進(jìn)行分離，根據(jù)洗脫液在280 nm下吸光度不同，將洗脫物合并為不同的分段組分，測定得到的樺褐孔菌子實體乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分的多酚和黃酮含量如圖2和圖3所示。由圖2可以得知，乙酸乙酯層分段洗脫物組分中SF3部分的多酚、黃酮含量明顯高于其他組分，分別達(dá)到163.71 mg和65.82 mg，多酚含量的由高到低依次為163.71 mg(SF3)、136.42 mg(SF1)、54.13 mg(SF5)、43.22 mg(SF2)、21.94 mg(SF4)，而黃酮含量由高到低為65.82 mg(SF3)、42.16 mg(SF2)、30.83 mg(SF1)、20.93 mg(SF4)、12.39 mg(SF5)。樺褐孔菌子實體乙酸乙酯層柱色譜分段組分多酚、黃酮含量由高到低的順序呈現(xiàn)不一致性，其可能是因為酚酸的干擾，因為酚酸是小分子的多酚，它的存在會使得多酚含量的增加，卻不會使得黃酮含量的增加，因此使得乙酸乙酯層柱色譜分段組分的的多酚、黃酮含量在高低順序上表現(xiàn)出了不一致性，與Kaewseejan等[15]所報道結(jié)果相一致。

圖2 子實體乙酸乙酯層柱色譜分段組分多酚和黃酮含量

樺褐孔菌子實體正丁醇層柱色譜分段洗脫物組分的多酚和黃酮含量如圖3所示，結(jié)果顯示：多酚的含量為74.21～261.06 mg，按多酚含量高低的順序為261.06 mg(SF2)、231.38 mg(SF4)、139.64 mg(SF5)、103.02 mg(SF3)、74.21 mg(SF1)，其中SF2和SF4這兩個組分的多酚含量是比較接近的，SF2(261.06 mg)要略高于SF4(231.38 mg)，其它三個組分的多酚含量與這兩個組分相比差距較大，要明顯少于這兩個組分。黃酮含量的范圍是34.13～85.12 mg，其黃酮含量的高低順序為85.12 mg(SF3)、56.33 mg(SF1)、51.63 mg(SF4)、48.73 mg(SF2)、34.13 mg(SF5)。與多酚含量相比，從圖3中可以看出，這五個組分的黃酮含量并沒有表現(xiàn)出很大的差異性。而且多酚含量和黃酮含量的高低順序也沒有表現(xiàn)出一致性。在這五個組分當(dāng)中，黃酮占多酚比重的最大是SF3，占比為82.6%；而占比最小的是SF2，為18.7%。

圖3 子實體正丁醇層柱色譜分段組分多酚和黃酮含量

2.3 子實體萃取物柱色譜分段組分的抗氧化活性

樺褐孔菌子實體乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分多酚的抗氧化活性的測定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明：乙酸乙酯層柱色譜分段組分的DPPHIC50值由低到高的順序依次為17.88 μg/mL(SF3)、20.67 μg/mL(SF2)、24.72 μg/mL(SF1)、26.23 μg/mL(SF4)、33.91 μg/mL(SF5)。DPPH的IC50值越小，表示其清除DPPH·能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)[18]。

對于TEAC法，其結(jié)果表示成TEAC值的形式，即每克多酚的含量相當(dāng)于Trolox物質(zhì)的摩爾數(shù)。TEAC法實際上測定的是多酚樣品對于ABTS·+的清除能力[20]。TEAC值越大，那么表示該組分的每1.0 g多酚樣品的抗氧化活性相當(dāng)于Trolox的摩爾數(shù)越大，繼而表示該組分多酚的抗氧化活性越強(qiáng)。由表1可知樺褐孔菌子實體乙酸乙酯層柱色譜分段五個組分TEAC值由大到小的順序為3.32 mmol(SF3)、2.72 mmol(SF2)、2.25 mmol(SF1)、1.96 mmol(SF4)、1.86 mmol(SF5)，以上結(jié)果表明：樺褐孔菌子實體乙酸乙酯層柱色譜分段五個組分的TEAC法抗氧化活性的大小順序與DPPH抗氧化活性的結(jié)果相一致。對于FRAP法，其結(jié)果表示成FRAP值的形式，即每克多酚的含量相當(dāng)于Trolox物質(zhì)的摩爾數(shù)。那么FRAP值越大代表該組分多酚的抗氧化活性越強(qiáng)[20]。表1顯示樺褐孔菌子實體乙酸乙酯層柱色譜分段五個組分的FRAP法抗氧化活性的大小順序依次為3.12 mmol(SF3)、2.36 mmol(SF2)、1.89 mmol(SF1)、1.37 mmol(SF4)、1.16 mmol(SF5)，與DPPH和TEAC法抗氧化活性的順序完全一致，說明這三種抗氧化活性的結(jié)果保持高度的一致性。樺褐孔菌子實體正丁醇層柱色譜分段組分多酚的三種抗氧化活性的測定結(jié)果也呈現(xiàn)出一致性，其中SF3組分具有最強(qiáng)的抗氧化活性，其DPPH IC50值、TEAC值、FRAP值分別為15.00 μg/mL，4.33 mmol/g和3.36 mmol/g。樺褐孔菌子實體正丁醇層柱色譜分段五個組分DPPH抗氧化活性的強(qiáng)弱順序依次為15.00 μg/mL(SF3)、17.30 μg/mL(SF1)、20.97 μg/mL(SF2)、23.59 μg/mL(SF4)、27.87 μg/mL(SF5)。樺褐孔菌子實體正丁醇層柱色譜分段五個組分的TEAC法和FRAP法的抗氧化活性強(qiáng)弱順序與DPPH法是一致的，這與乙酸乙酯層相同。與乙酸乙酯層相比，子實體正丁醇層表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抗氧化活性。正丁醇層柱色譜分段的最強(qiáng)抗氧化活性組分SF3相比于乙酸乙酯層柱色譜分段的最強(qiáng)抗氧化活性組分SF3表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抗氧化活性。其TEAC值和FRAP值與Du等[20]做得植物多酚的結(jié)果相比更高，抗氧化活性更強(qiáng)。樺褐孔菌子實體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層的最強(qiáng)抗氧化活性組分DPPH IC50值分別為17.88 μg/mL和15.00 μg/mL，均低于Kaewseejan等[15]等對植物多酚的研究結(jié)果，因此樺褐孔菌子實體多酚進(jìn)行分離純化后具有很強(qiáng)的抗氧化活性。

表1 子實體多酚柱色譜分段組分的抗氧化活性

注：表中不同字母表示有顯著性差異(p<0.05)。

2.4 抗氧化活性與黃酮含量的相關(guān)性分析

DPPH、TEAC和FRAP三種抗氧化活性與黃酮含量相關(guān)性分析的結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明：DPPH抗氧化活性相關(guān)性與黃酮含量的相關(guān)系數(shù)為0.909，F(xiàn)RAP法抗氧化活性的相關(guān)性系數(shù)為0.957，TEAC法抗氧化活性的系數(shù)為0.822，因此黃酮是抗氧化活性的主導(dǎo)物質(zhì)。黃酮是優(yōu)質(zhì)的抗氧化劑，作為氫和電子的供體來說具有很高的反應(yīng)活性[21]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)DPPH、TEAC和FRAP三種抗氧化活性之間也顯示很強(qiáng)的相關(guān)性，r值均高于0.873。因此黃酮作為一種抗氧化劑，對抗氧化活性起著非常重要的作用。

表2 黃酮含量和抗氧化活性的相關(guān)性分析

注：DPPHIC50: DPPH·清除活性;TEAC: Trolox equivalent antioxidant capacity, ABTS·+清除活性; FRAP: Ferric ion reducing antioxidant power,鐵離子還原能力。

3 結(jié) 論

樺褐孔菌子實體含有大量的生物活性成分，在這些生物活性成分中多酚有著很強(qiáng)的抗氧化活性，本文采用有機(jī)溶劑提取和柱色譜分離純化的方法對樺褐孔菌子實體多酚進(jìn)行研究，主要結(jié)論如下：

a) 樺褐孔菌子實體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分中都是SF3表現(xiàn)出最高的抗氧化活性，其中正丁醇層的SF3的抗氧化活性要高于乙酸乙酯層的SF3。

b) 子實體多酚柱色譜分段組分的DPPH、TEAC和FRAP三種抗氧化活性在強(qiáng)弱上呈現(xiàn)一致性，相關(guān)性系數(shù)都達(dá)到0.873。

c) 黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性系數(shù)也達(dá)到了0.822，黃酮在子實體多酚的抗氧化活性中起重要作用。

本文基于葡聚糖凝膠Sephadex LH-20對子實體多酚的初步分離為進(jìn)一步地研究樺褐孔菌中多酚組分的鑒定奠定基礎(chǔ)。