甲狀腺髓樣癌中Rb和CyclinD1蛋白的表達(dá)及意義*

江 荷，劉 英，羅添友，江小林，唐 穎，李 麗，姜 勇Δ

1.四川大學(xué)華西醫(yī)院 病理科·病理研究室(成都 610041)；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科(成都 610041)

甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)起源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞，約占甲狀腺惡性腫瘤的1%～2%[1]，但卻導(dǎo)致了14%的甲狀腺癌患者死亡[2]。 MTC侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差，其5年、10年生存率分別為86%、65%[3]。確診時(shí)約半數(shù)已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，約10%已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，后者10年生存率僅40%左右[4]。MTC對(duì)放、化療不敏感，主要治療方法為手術(shù)治療。目前雖有研究把腫瘤基因突變、降鈣素水平和癌胚抗原視為髓樣癌的獨(dú)立預(yù)后因素[5]，但尚缺乏蛋白水平的有效預(yù)后標(biāo)志物。Rb蛋白是由RB抑癌基因編碼的一種長(zhǎng)110 kd的周期蛋白，可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及惡性轉(zhuǎn)化，目前Rb蛋白應(yīng)用于髓樣癌的研究較少，且樣本量也有限[6-7]。CyclinD1蛋白是由癌基因CyclinD1編碼的一種周期蛋白，過(guò)量CyclinDl可致細(xì)胞生長(zhǎng)失控并惡變，國(guó)內(nèi)外有研究[8-9]報(bào)道了CyclinD1蛋白在甲狀腺非髓樣癌中過(guò)表達(dá)與腫瘤預(yù)后的關(guān)系[8-9]，但尚未見(jiàn)該蛋白在髓樣癌中的表達(dá)研究。本研究采用免疫組化S-P方法檢測(cè)106例MTC中Rb和CyclinD1蛋白表達(dá)情況，并分析兩者相關(guān)性及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科2010年1月-2016年12月確診為MTC并行手術(shù)切除的病例，篩選有隨訪(fǎng)資料的106例病例進(jìn)行分析。所有病例經(jīng)兩名病理醫(yī)師復(fù)核切片并達(dá)成診斷共識(shí)。其中男38例，女68例?；颊吣挲g11～82(45.7±12.08)歲。腫瘤最大直徑3～80(25.8±8.03)mm。23例出現(xiàn)脈管癌栓(圖1A)，40例出現(xiàn)被膜侵犯。64例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖1B)。根據(jù)第8版AJCC髓樣癌TNM分期[10]：I期+Ⅱ期61例，Ⅲ期+Ⅳ期45例。中位隨訪(fǎng)時(shí)間為51個(gè)月。

1.2 免疫組化方法及結(jié)果判讀

采用免疫組化S-P法檢測(cè)腫瘤組織中Rb和CyclinD1蛋白表達(dá)情況。Rb抗體(克隆號(hào)13A10 ，購(gòu)自北京中杉金橋公司)，稀釋濃度為1∶50;CyclinD1抗體(克隆號(hào)EP12，購(gòu)自北京中杉金橋公司)，稀釋濃度為1∶100。免疫組化遵照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行，并設(shè)置空白、陰性及陽(yáng)性對(duì)照。Rb及CyclinD1蛋白均表達(dá)在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)，棕黃色為陽(yáng)性著色。參考文獻(xiàn)[11]將Rb蛋白在腫瘤組織的表達(dá)分為Rb陽(yáng)性(≥75%)(圖1C)與陰性(<75%)。CyclinD1判讀參考文獻(xiàn)[12]設(shè)置的界限值，分為陽(yáng)性(>10%)(圖1D)及陰性(≤10%)。

圖1 MTC的鏡下表現(xiàn)及Rb、cyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Rb蛋白表達(dá)與MTC臨床病理特征關(guān)系

84例(69.2%)Rb染色陽(yáng)性，Rb蛋白低表達(dá)僅與癌栓形成與否有關(guān)(P<0.05)(表1)。通過(guò)單因素分析發(fā)現(xiàn)，Rb低表達(dá)與髓樣癌低生存有關(guān)(P=0.02)(圖2)。

2.2 CyclinD1蛋白表達(dá)與MTC臨床病理特征的關(guān)系

76例(71.6%)CyclinD1染色陽(yáng)性，CyclinD1表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期有關(guān)(P<0.05)(表1)。未發(fā)現(xiàn)CyclinD1蛋白高表達(dá)與MTC預(yù)后有關(guān)(P=0.79)。

表1 Rb、CyclinD1蛋白與MTC臨床病理特征的關(guān)系

圖2 MTC中Rb蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

2.3 Rb和CyclinDl蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Rb與CyclinDl蛋白陽(yáng)性表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.453，P<0.01)(表2)。

表2 MTC組織中Rb蛋白和CyclinDl 蛋白表達(dá)的關(guān)系

3 討論

3.1 MTC中Rb的表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

Rb蛋白由RB基因編碼，可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，Rb功能缺失可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。在小鼠模型中， Rb功能缺失將導(dǎo)致MTC的發(fā)生[13]。有研究[14]認(rèn)為，該通路也許是人類(lèi)MTC發(fā)生的潛在重要途徑。有研究[6-7]表明，Rb在髓樣癌中的表達(dá)率低于良性甲狀腺腫瘤，但目前Rb蛋白運(yùn)用于髓樣癌的研究較少,而在甲狀腺非髓樣癌中研究較多。例如，Anwar等[15]研究提示，Rb蛋白在甲狀腺惡性腫瘤中呈低表達(dá)現(xiàn)象。但Ferenc[16]等卻發(fā)現(xiàn)，Rb蛋白在甲狀腺濾泡癌中幾乎全表達(dá)，同樣Holm等[6]的研究也顯示，Rb蛋白在甲狀腺癌中未出現(xiàn)表達(dá)缺失。以上研究結(jié)果不同可能是判斷Rb陽(yáng)性的臨界值不一樣造成的。最近Anisley等[11]研究顯示，Rb蛋白表達(dá)狀態(tài)與髓樣癌臨床病理特征之間無(wú)關(guān)，但Rb低表達(dá)是MTC患者獨(dú)立的預(yù)后因素。Rb低表達(dá)與預(yù)后不良的關(guān)系在胃腺癌[17]和肺非小細(xì)胞癌[18]中也被發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果和上述文獻(xiàn)一致，但和Valenciaga等[11]研究不一致，本研究還發(fā)現(xiàn)Rb蛋白低表達(dá)與脈管內(nèi)癌栓之間關(guān)系顯著，脈管內(nèi)癌栓往往預(yù)示了腫瘤的轉(zhuǎn)移，這也許是它和預(yù)后不良之間關(guān)聯(lián)的解釋。

3.2 MTC中CyclinD1的表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

CyclinDl是重要的細(xì)胞周期蛋白之一， 它通過(guò)與蛋白CDK4/6結(jié)合形成CyclinDl-CDK4/6復(fù)合物，促使下游Rb蛋白磷酸化失活，致使與Rb結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F獲得釋放，從而使細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變。過(guò)量CyclinDl可致細(xì)胞生長(zhǎng)失控及惡變，且提示腫瘤預(yù)后較差。CyclinDl過(guò)表達(dá)與許多惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),包括頭頸部基底細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等。有研究[19]表明，該蛋白在頭頸部鱗癌中過(guò)表達(dá)提示預(yù)后不良，但在乳腺癌和肺非小細(xì)胞癌中過(guò)表達(dá)的意義尚存爭(zhēng)議[18,20]。目前CyclinDl蛋白在甲狀腺非髓樣癌中的研究較多見(jiàn)，有研究[8-9]顯示，CyclinD1蛋白的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及被膜侵犯有關(guān)，除此之外，劉珊等[8]和Basolo等[9]還發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌中CyclinDl表達(dá)水平與患者年齡有關(guān)。本研究中CyclinD1在MTC組織中的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期顯著相關(guān)，而與患者年齡無(wú)關(guān)，與其在甲狀腺乳頭狀癌中的研究結(jié)果基本一致。關(guān)于CyclinD1蛋白在MTC中的表達(dá)與預(yù)后的研究較少。Sporny等[21]僅發(fā)現(xiàn)，CyclinDl蛋白在髓樣癌中表達(dá)陽(yáng)性率高于在乳頭狀癌中的表達(dá)陽(yáng)性率，但因納入的髓樣癌有限，未探究其與預(yù)后的關(guān)系。本研究單因素分析提示，CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)與髓樣癌預(yù)后無(wú)關(guān)。到目前為止，CyclinD1在其他部位惡性腫瘤預(yù)后中扮演的角色不一，有待繼續(xù)探討。如 Brambillae等[22]研究提示，在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)CyclinD1表達(dá)狀態(tài)與生存率無(wú)關(guān)，但在卵巢漿液性癌中的研究表明，CyclinD1過(guò)表達(dá)與患者的低生存率有關(guān)[12]。

3.3 MTC中Rb、CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性

許多基因參與了MTC的腫瘤發(fā)生。Rb基因功能喪失將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性增殖，而CyclinDl在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，它可以調(diào)節(jié)Rb蛋白磷酸化。本研究對(duì)MTC中CyclinD1和Rb表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者陽(yáng)性率呈一定的正相關(guān)性(r=0.453，P<0.01)。先前有研究[21]顯示，在肺非小細(xì)胞肺癌中CyclinD1過(guò)表達(dá)與Rb蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系,兩者出現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系的可能原因是，CyclinD1蛋白在其他Rb家族基因(如Rb2、Rb3)中也有特定靶點(diǎn)，從而掩蓋了單一的分子貢獻(xiàn)。在本研究中，CyclinD1過(guò)表達(dá)而Rb表達(dá)陰性的病例只有7例。 Ferenc[16]和Basolo等[9]在分析CyclinD1和Rb蛋白在甲狀腺濾泡癌中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，CyclinD1與Rb蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)，得出上述不同結(jié)論的原因可能是：研究樣本數(shù)量少；CyclinD1和Rb的調(diào)節(jié)會(huì)受到其他因素(如p16、CDKs)影響。

綜上所述，Rb蛋白在髓樣癌中的低表達(dá)與癌栓形成有關(guān)， Rb蛋白低表達(dá)是MTC的預(yù)后因素。CyclinD1蛋白在MTC的表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期有關(guān)，但該蛋白不是MTC的預(yù)后因素。在MTC中CyclinD1和Rb表達(dá)陽(yáng)性率呈正相關(guān)，其原因有待進(jìn)一步探討。Rb蛋白可作為MTC總生存率的預(yù)測(cè)指標(biāo)。