木香檳榔丸中枳殼的質(zhì)量控制研究

文永盛，彭善貴，雷 蕾

成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院(成都 610045)

木香檳榔丸是由木香、檳榔、枳殼、香附、三棱、莪術(shù)等十三味中藥加工制成的水丸，具有行氣導(dǎo)滯，瀉熱通便之功效，是國(guó)家醫(yī)保急用藥品[1]。方中枳殼與藥品功能主治密切相關(guān)，投料枳殼藥材質(zhì)量及數(shù)量，直接影響藥品療效。本品收入《中國(guó)藥典》2015年版，原標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有枳殼的薄層鑒別和含量測(cè)定，為保證藥品質(zhì)量，確保臨床療效，本研究對(duì)木香檳榔丸標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了完善提高，增加了枳殼的薄層鑒別和含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)便可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters2998高效液相色譜儀、Waters-e2695 Photodiode Array Detector 檢測(cè)器、Empower pro自動(dòng)進(jìn)樣色譜工作站(美國(guó)沃特世)；AE240電子天平(感量0.1 mg、0.01 mg)(德國(guó)賽多利斯)。乙腈為色譜純，其他試劑試藥均為分析純。柚皮苷(純度94.7%,批號(hào)：110722-201312)、新橙皮苷(純度99.6%,批號(hào)：111857-201102)，枳殼對(duì)照藥材(批號(hào)：120981-200604)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；5批木香檳榔丸分別由北京、山東、山西三家不同企業(yè)提供。

1.2 方法

1.2.1 枳殼的薄層鑒別方法 取木香檳榔丸樣品研細(xì)，取2 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取枳殼對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇10 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液[2]。再取柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 各含0.5 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。取供試品和對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸 (13∶6∶2.2∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視[3]。

1.2.2 枳殼的含量測(cè)定方法 1)色譜條件:色譜柱選用Waters Symmetry shield TM RP18(250×4.6 mm，5 μm)(美國(guó)沃特世)；流動(dòng)相選用乙腈-0.1%磷酸(18∶82)；流速為1.0 mL/min；選擇柚皮苷、新橙皮苷及供試品溶液的共同最大吸收波長(zhǎng)283 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)[4]。2) 對(duì)照品溶液的制備:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定數(shù)據(jù)分析，確定柚皮苷和新橙皮苷50 μg/mL 的甲醇溶液為對(duì)照品溶液。3) 供試品溶液的制備:取木香檳榔丸細(xì)分約1 g，加甲醇50 mL 回流提取1 h，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。分別對(duì)取樣量、提取溶媒、提取方法、提取時(shí)間進(jìn)行了考察：①參照《中國(guó)藥典》2015年版第1部“枳殼”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定限度[5]，并對(duì)木香檳榔丸樣品的實(shí)際含量測(cè)定可知，取樣量為1.0 g 較好。②取樣品3份，每份1.0 g，分別選用甲醇、50%甲醇、乙醇作提取溶媒，其他條件不變，取濾液測(cè)定含量，比較含量和色譜峰形。③取樣品2份，每份1.0 g，分別選用回流提取和超聲處理兩種提取方法，其他條件不變，取濾液測(cè)定含量，比較含量和色譜峰形。④取樣品3份，每份1.0 g，分別選用回流提取0.5、1.0、1.5 h，其他條件不變，取濾液測(cè)定含量，比較含量高低[6]。4) 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn):取缺枳殼、陳皮、青皮陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液，分析測(cè)試，觀察實(shí)驗(yàn)圖譜。5) 線(xiàn)性關(guān)系考察:精密稱(chēng)取柚皮苷11.32 mg、新橙皮苷10.94 mg，分別置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，作為對(duì)照品濃溶液母液，再精密量取上述濃溶液各5 mL 置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液A；取混合對(duì)照品溶液A 5 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作混合對(duì)照品溶液B。精密吸取對(duì)照品溶液A 5、10、15 μL，對(duì)照品溶液B 2、5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，考察線(xiàn)性關(guān)系并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。6) 穩(wěn)定性和精密度實(shí)驗(yàn):對(duì)同一份供試品溶液，分別于0、4、8、16、24 h測(cè)定，記錄各次峰面積進(jìn)行比較，考察其穩(wěn)定性。對(duì)同一份柚皮苷(0.042 9 mg/mL)和新橙皮苷(0.043 6 mg/mL)混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄各自峰面積，考察進(jìn)樣精密度。7) 重復(fù)性試驗(yàn):對(duì)同一批樣品按上述方法制成供試品溶液，平行測(cè)定6次，分別計(jì)算6次的含量，考察方法的重復(fù)性。8)加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量樣品(柚皮苷：3.35 mg/g 、新橙皮苷： 2.5 mg/g)6份，置具塞三角瓶中，分別精密加入柚皮苷對(duì)照品溶液(0.214 4 mg/mL)、新橙皮苷對(duì)照品溶液(0.217 9 mg/mL)各2、2、3、3、4、4 mL，再分別精密加入甲醇25 mL，按上述方法制成供試液，測(cè)定含量，以下式計(jì)算回收率。

2 結(jié)果

2.1 枳殼的薄層鑒別

枳殼薄層鑒別分離較好，檢出斑點(diǎn)清晰，陰性樣品無(wú)干擾，方法簡(jiǎn)單可行，能用于樣品中枳殼的定性鑒別(圖1)。

圖1 枳殼的TLC圖

2.2 供試品溶液的制備

當(dāng)取樣量為1.0 g時(shí)，供試品溶液濃度與對(duì)照品溶液濃度相當(dāng)，峰高適中，柱效高，峰形好；提取溶媒選用甲醇，回流提取含量比超聲提取略高，回流提取0.5 h后，柚皮苷和新橙皮苷已基本溶解平衡，結(jié)果選擇加熱回流提取1.0 h。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)

柚皮苷進(jìn)樣量在0.0428 8 ～0.643 2 μg 范圍內(nèi)與峰面積成良好的線(xiàn)性關(guān)系；回歸方程：y=303.668 3x+836.945 4；相關(guān)系數(shù)：R2=0.999 6；新橙皮苷進(jìn)樣量在0.043 6 ～0.653 8 μg 范圍內(nèi)與峰面積成良好的線(xiàn)性關(guān)系；回歸方程：y=2 059 574.507 2x+302.668 3；相關(guān)系數(shù)：R2=0.999 8。

2.4 穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，5次試驗(yàn)測(cè)定峰面積RSD小于0.2%，能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要；柚皮苷和新橙皮苷混合對(duì)照品溶液5次重復(fù)測(cè)得峰面積RSD小于1.0%，進(jìn)樣精密度較好；6份樣品平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得含量RSD小于0.5%，方法重復(fù)性良好。

2.5 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)

專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)顯示陰性樣品在柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品相應(yīng)色譜峰位置未檢出色譜峰，陰性無(wú)干擾(圖2～4)。

圖2 柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品HPLC圖譜(從左至右依次為柚皮苷和新橙皮苷)

圖3 木香檳榔丸樣品HPLC圖譜

圖4 缺枳殼、陳皮、青皮陰性樣品HPLC圖譜

2.6 加樣回收試驗(yàn)

柚皮苷平均加樣回收率97.7%，RSD=0.88% (n=6)，新橙皮苷平均加樣回收率99.09%，RSD=0.91%(n=6)，表明回收率重現(xiàn)性較好，測(cè)定方法可靠，可用于木香檳榔丸的質(zhì)量控制，回收率相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1～2。

表1 柚皮苷回收率測(cè)定(n=6)

表2 新橙皮苷回收率測(cè)定(n=6)

2.7 樣品含量測(cè)定

按擬定的含量測(cè)定方法對(duì)5家企業(yè)來(lái)自3個(gè)省市的木香檳榔丸樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果方法重現(xiàn)性、精密度、色譜峰分離度均較好(表3)。

表3 樣品含量測(cè)定(mg/g, n=2)

3 討論

原木香檳榔丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有枳殼質(zhì)量控制項(xiàng)。通過(guò)對(duì)不同生產(chǎn)企業(yè)5批木香檳榔丸樣品測(cè)定發(fā)現(xiàn)，柚皮苷和新橙皮苷含量相差很大，造成的原因可能不一，但對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量和療效有很大影響。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可初步認(rèn)為：北京A企業(yè)生產(chǎn)的木香檳榔丸枳殼含量與處方量相匹配；山東B企業(yè)未檢出柚皮苷，檢出少量新橙皮苷，可能投料藥材種屬錯(cuò)誤或投料不足；山西C企業(yè)兩批樣品含量相差較大，初步判定投料不足或投料藥材質(zhì)量參差不齊。

枳殼具有理氣寬中，行滯消脹的功效，與成品藥功能密切相關(guān)[7]。而枳殼用藥品種較為混亂，《中國(guó)藥典》規(guī)定枳殼為蕓香科植物酸橙及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)[5]，常與枳實(shí)及橘、柚的幼果混淆，這些幼果所含成分不盡相同，或相同成分的比例相差很大[8]，通過(guò)枳殼對(duì)照藥材和柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品的薄層鑒別，可以鑒定處方用藥是否正確；通過(guò)柚皮苷、新橙皮苷含量測(cè)定，可以鑒定處方用藥量是否合理。

木香檳榔丸處方中含有陳皮和青皮，陳皮和青皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥果皮，主要含有橙皮苷，也含少量新橙皮苷，但不含有柚皮苷，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的新橙皮苷應(yīng)為枳殼、陳皮和青皮所含新橙皮苷的總和[9]。故在含量測(cè)定方法中，應(yīng)分別制定柚皮苷和新橙皮苷的限度，方能保證產(chǎn)品質(zhì)量。

綜上所述，本研究采用薄層色譜法和液相色譜法從定性和定量?jī)煞矫嬖u(píng)價(jià)木香檳榔丸內(nèi)在質(zhì)量，為生產(chǎn)企業(yè)和管理部門(mén)提供了參考思路和方法。