體外過表達(dá)Foxp1對多巴胺神經(jīng)元分化的影響*

左 璇，趙海霞，吳科曉，李云竹，蘇炳銀，李淑蓉Δ

1.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室(成都 610500)；2. 發(fā)育與再生四川省重點實驗室(成都 610500)；3. 成都醫(yī)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室(成都 610500)

中腦多巴胺神經(jīng)元(midbrain dopaminergic neuron，mDAn)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生多巴胺類神經(jīng)遞質(zhì)的主要神經(jīng)元，參與運動調(diào)節(jié)、情緒、獎賞、抑郁等生理過程。mDAn的功能異常與一系列神經(jīng)精神疾病如帕金森病、精神分裂癥、成癮癥、抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子在mDAn的發(fā)育過程中扮演重要角色，有關(guān)mDAn發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制歷來是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[1]。

轉(zhuǎn)錄因子Foxp1(forkhead box protein P1,Foxp1)是Foxp家族的一員，F(xiàn)oxp1 能夠與多種基因的啟動子及增強子相結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用以調(diào)節(jié)多種基因的時空表達(dá)[2]。研究[3-6]結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp1基因缺陷可造成明顯的認(rèn)知障礙、智力低下、自閉癥譜系癥候群以及語言功能障礙。此外，F(xiàn)oxp1在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)范圍十分廣泛，在發(fā)育中的前腦、脊索、紋狀體、丘腦以及皮層中均有表達(dá)，提示Foxp1參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。有關(guān)Foxp1在mDAn發(fā)育中作用的研究鮮有報道。本課題組前期觀察發(fā)現(xiàn)Foxp1在胚胎發(fā)育早期中腦腹側(cè)表達(dá)，提示Foxp1可能在mDAn的早期發(fā)育過程中發(fā)揮作用。為進(jìn)一步探究Foxp1對多巴胺神經(jīng)元分化的影響，本研究首先構(gòu)建了Foxp1過表達(dá)載體，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至MN9D細(xì)胞，然后通過RT-qPCR技術(shù)檢測多巴胺神經(jīng)元分化相關(guān)基因Foxa2、Ngn2、Pitx3、Th的表達(dá)水平，初步探究轉(zhuǎn)錄因子Foxp1在mDAn分化中的作用，為進(jìn)一步完善多巴胺神經(jīng)元分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制提供一定的理論支持，同時為Foxp1突變相關(guān)神經(jīng)精神疾病的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細(xì)胞

實驗動物：野生型C57/BL6小鼠，約4周齡，體重約20 g，購自成都達(dá)碩實驗動物公司。配種野生型雄性及雌性性成熟小鼠，檢栓并計算孕齡，獲取E10.5、E15.5天胎鼠。實驗用細(xì)胞：MN9D細(xì)胞(ATCC來源)。

1.2 實驗試劑及設(shè)備

實驗所用引物序列均由美國Invitrogen公司合成。試劑：DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、1% Penicillin-Streptomycin、Lipofectamine 2000、Trizol均購自美國Invitrogen公司、胎牛血清購自德國PAN公司；兔源抗小鼠Foxp1 抗體、兔源抗小鼠Th抗體購自美國Millipore公司、Alexa Fluor?488 goat anti-rabbit IgG購自美國Invitrogen公司、DAPI染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。高保真Taq酶購自日本Takara公司、EcoRI-HF、BamHI-HF以及T4連接酶購自美國NEB公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit以及熒光定量PCR檢測試劑盒Fast Start Universal SYBR Green Master購自美國Roche公司。設(shè)備：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司、電泳及凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀及CFX96TmReal-Time System購自美國Bio-Rad公司、正置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司、冰凍切片機購自美國Thermo公司。

1.3 免疫熒光染色

取E10.5、E15.5天胚胎腦組織樣品，4% PFA固定過夜，30% 蔗糖脫水沉淀，冷凍包埋，收集中腦連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm。選取腹側(cè)中腦所在部位進(jìn)行免疫熒光染色。組織切片烘干，組織復(fù)水，滴加透化性封閉液至樣品表面，室溫封閉1 h，滴加一抗兔源抗小鼠Foxp1 抗體、兔源抗小鼠Th抗體(1∶200稀釋)至樣品表面4 ℃孵育過夜，洗滌，滴加二抗Alexa Fluor?488 goat anti-rabbit IgG(1∶400稀釋)至樣品表面室溫孵育2 h，洗滌，滴加DAPI染色液，中性樹膠封片，置于正置熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.4 Foxp1過表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計含有BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點的Foxp1引物，體外PCR擴增獲得目的基因，將目的基因及載體pIRES2-EGFP分別應(yīng)用BamHⅠ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，所得目的基因及載體酶切產(chǎn)物應(yīng)用T4連接酶進(jìn)行連接，連接成功后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH-5α 中，鋪板培養(yǎng)14 ～16 h后，挑選能夠在Kana抗性培養(yǎng)板生長的菌落，搖菌擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒送檢測序。

實驗涉及引物序列：Foxp1-EcoRI上游：5'-CCGGAATTCGCCACCATGATGCAAGAATCTGGGTC-3'；Foxp1-BamHI下游：5'-CGCGGATCCTCACTCCATGTCCTCATTTACTG-3'。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染技術(shù)

MN9D細(xì)胞培養(yǎng)于含有1%Penicillin-Streptomycin(雙抗)、10%FBS(胎牛血清)的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁生長，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時進(jìn)行傳代操作。操作時倒掉原培養(yǎng)基，以滅菌1×PBS適量沖洗培養(yǎng)瓶，加入0.25%胰酶1 mL，橫直培養(yǎng)瓶使其充分接觸細(xì)胞，消化約3 min左右可見細(xì)胞脫落，收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管內(nèi)，低速離心機離心1 000 r/min，離心5 min，可見細(xì)胞沉淀于管底，倒去上層液體，以1 mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，充分混勻，動作應(yīng)盡量輕柔。以1∶3吸取300 μL細(xì)胞懸液，加入含有新鮮培養(yǎng)基5 mL的培養(yǎng)瓶內(nèi)。輕輕晃動瓶體，使細(xì)胞均勻分布，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞需傳代2～3次后方可進(jìn)行后續(xù)實驗操作。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作前1 d，將MN9D細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，接種密度以細(xì)胞密度達(dá)70%～80%為宜。第2天，見細(xì)胞貼壁生長良好，密度為80%左右。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合體轉(zhuǎn)染DNA 50 ng/孔，分別配置A、B液。A液：DNA 50 ng/孔，DMEM/F12補足至25 μL，混合均勻。B液：Lipo2000 2 μL/孔，DMEM/F12補足至25 μL，混合均勻。將B液加入A液中混勻，室溫靜置5 min。按照50 μL/孔標(biāo)準(zhǔn)，將混合液加入孔板內(nèi)，注意加液時應(yīng)逐滴分散加入。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 RT-qPCR技術(shù)

MN9D細(xì)胞轉(zhuǎn)染Foxp1過表達(dá)載體后，應(yīng)用含有丁酸鈉的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化3 d。Trizol法收集總RNA。所得RNA應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體方法步驟參照試劑盒說明。以cDNA為模版應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測目的基因表達(dá)情況。

引物序列：GAPDH上游：5'-GAAACCTGCCAAGTATGATGACA-3'，下游：5'-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAGA-3'；Foxp1上游：5'-TCTCGTCCTCGGCACCTT-3'，下游：5'-GTCACAAACCGCCTCACA-3'；Foxa2上游：5'-GCTGCAGACACTTCCTACTACCA-3'，下游：5'-CCAAAGTCTCCACTCAGCCTC-3'；Ngn2上游：5'-CATCTGGAGCCGCGTAGG-3'，下游：5'-GGACATCGGGGTCAGGGT-3'；Pitx3上游：5'-TCCAGAGGAATCGCTACCC-3'，下游：5'-GCCGGTTCTTGAACCACA-3'；Th上游：5'-TCCTCAGTTCTGTGCGTCG-3'，下游：5'-CAGGTCCAGGTCAGGGTCA-3'。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Foxp1在胚胎發(fā)育早期E10.5天小鼠中腦腹側(cè)的表達(dá)

通過免疫熒光染色，于連續(xù)切片中分別標(biāo)記Foxp1、Th，觀察二者在胚胎早期E10.5天小鼠中腦的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Th在胚胎早期E10.5天便已經(jīng)開始表達(dá)，其特異性地表達(dá)于中腦腹側(cè)。Foxp1同樣表達(dá)于中腦腹側(cè)，二者在該時期的表達(dá)存在顯著重疊(圖1)。

圖1 Foxp1在胚胎發(fā)育早期E10.5天小鼠中腦的表達(dá)注：A-C：E10.5天中腦Th的表達(dá)；D-F：E10.5天中腦Foxp1的表達(dá)；DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，呈現(xiàn)藍(lán)色；Th標(biāo)記多巴胺神經(jīng)元，呈現(xiàn)綠色

2.2 Foxp1在胚胎發(fā)育晚期E15.5天小鼠中腦的表達(dá)

通過免疫熒光染色，于連續(xù)切片中分別標(biāo)記Foxp1、Th，觀察二者在胚胎發(fā)育晚期E15.5天小鼠中腦的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較E10.5天而言，E15.5天時可觀察到mDAn發(fā)生顯著遷移，形成中腦腹側(cè)被蓋VTA及黑質(zhì)致密部SNc。該時期，F(xiàn)oxp1表達(dá)于Th陽性細(xì)胞下方，二者間無重疊表達(dá)(圖2)。

圖2 Foxp1在胚胎發(fā)育晚期E15.5天小鼠中腦的表達(dá)注：A-C：E15.5天中腦Th的表達(dá)；D-F：E15.5天中腦Foxp1的表達(dá)；DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，呈現(xiàn)藍(lán)色；Th標(biāo)記多巴胺神經(jīng)元，呈現(xiàn)綠色

2.3 Foxp1過表達(dá)載體的構(gòu)建

通過對目的基因PCR擴增片段以及Foxp1過表達(dá)載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR擴增所得產(chǎn)物大小約2.5 kb，與Foxp1目的基因片段長度一致；Foxp1過表達(dá)載體酶切后電泳條帶顯示過表達(dá)載體成功酶切為目的片段及載體片段兩部分(圖3)。

圖3 構(gòu)建EGFP、EGFP-Foxp1重組質(zhì)粒

2.4 多巴胺神經(jīng)元MN9D細(xì)胞中過表達(dá)Foxp1

通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Foxp1在MN9D細(xì)胞中的過表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組較對照組Foxp1表達(dá)水平明顯升高，表明Foxp1在MN9D細(xì)胞中過表達(dá)成功(圖4)。

2.5 過表達(dá)Foxp1對多巴胺神經(jīng)元分化相關(guān)基因的影響

通過實時熒光定量PCR技術(shù)觀察Foxp1過表達(dá)后，MN9D細(xì)胞中多巴胺神經(jīng)元分化相關(guān)基因Foxa2、Ngn2、Pitx3、Th的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Foxp1后，F(xiàn)oxa2、Ngn2表達(dá)水平明顯升高而Pitx3、Th表達(dá)未見明顯變化(圖5)。

圖5 過表達(dá)Foxp1對多巴胺神經(jīng)元分化相關(guān)基因的影響注：n=3，*P<0.05

3 討論

mDAn作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的主要神經(jīng)元，其功能異常與一系列神經(jīng)精神疾病的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的退行性變可引起帕金森病。有關(guān)mDAn發(fā)育發(fā)生機制的各項研究[7]結(jié)果表明，多巴胺神經(jīng)元的發(fā)育分化過程受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

小鼠中腦黑質(zhì)及腹側(cè)被蓋的多巴胺神經(jīng)元均起源于腹側(cè)底板區(qū)，其發(fā)育主要經(jīng)歷3個階段：前體細(xì)胞的區(qū)域化誘導(dǎo)；前體細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元的特化；成熟多巴胺神經(jīng)元表型的獲得以及多巴胺神經(jīng)元的終末分化[8]。前體細(xì)胞區(qū)域化誘導(dǎo)階段受到轉(zhuǎn)錄因子Foxα1/2、En1/2、Lmx1a/b、Ngn2調(diào)控，研究[9]結(jié)果顯示，F(xiàn)oxa2雜合型小鼠可出現(xiàn)散發(fā)性的多巴胺神經(jīng)元發(fā)育延緩以及運動功能異常，而Ngn2突變小鼠在胚胎發(fā)育E14.5及E17.5天即可造成約86%及66%多巴胺神經(jīng)元的發(fā)育缺陷[10]。伴隨著胚胎的不斷發(fā)育，前體細(xì)胞逐漸特化為多巴胺神經(jīng)元并開始表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Nurr1、Pitx3。值得注意的是，Pitx3僅特異性的表達(dá)于mDAn，并且Pitx3敲除可造成中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)目減少[11]。在表達(dá)Nurr1、Pitx3等轉(zhuǎn)錄因子后，多巴胺神經(jīng)元的表型開始出現(xiàn)并合成多巴胺。Th、Vmat的表達(dá)與成熟多巴胺神經(jīng)元表型的獲得密切相關(guān)。據(jù)此可見，多巴胺神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在其正常發(fā)育過程中至關(guān)重要。

本課題組前期實驗中運用免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)Th早在胚胎發(fā)育早期E10.5天便開始表達(dá)，在該時期，F(xiàn)oxp1表達(dá)于Th陽性細(xì)胞中。胚胎發(fā)育至E15.5天，較發(fā)育早期而言多巴胺神經(jīng)元發(fā)生顯著的細(xì)胞遷移，分別形成中腦腹側(cè)被蓋VTA區(qū)以及黑質(zhì)致密部SNc區(qū)。在該時期，F(xiàn)oxp1表達(dá)于多巴胺神經(jīng)元下方的部分區(qū)域內(nèi)，二者之間無重疊表達(dá)。這一結(jié)果表明Foxp1參與調(diào)節(jié)mDAn發(fā)育的時間窗較短，僅在胚胎早期發(fā)揮作用，可能影響胚胎早期多巴胺神經(jīng)元的特化或分化進(jìn)程，而對胚胎晚期多巴胺神經(jīng)元的表型獲得及維持影響較小。

MN9D細(xì)胞是由小鼠胚胎腹側(cè)中腦細(xì)胞與成神經(jīng)細(xì)胞瘤雜交而獲得。研究[12]顯示，MN9D細(xì)胞作為多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞系，經(jīng)丁酸鈉誘導(dǎo)分化后，可具備在體內(nèi)多巴胺神經(jīng)元的某些特性，如Th表達(dá)陽性、能夠吸收、合成及釋放DA等。因此被廣泛應(yīng)用于多巴胺神經(jīng)元分化的相關(guān)體外實驗研究。本研究通過在MN9D細(xì)胞中過表達(dá)Foxp1，探究過表達(dá)Foxp1對多巴胺神經(jīng)元分化相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Foxp1過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)Foxa2以及Ngn2的表達(dá)，而對Pitx3、Th的表達(dá)無明顯影響。Foxα2、Ngn2被認(rèn)為是分化早期多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)記因子，而Pitx3、Th則是分化晚期及成熟多巴胺神經(jīng)元的標(biāo)記因子[13-16]。這表明，F(xiàn)oxp1主要參與調(diào)節(jié)多巴胺神經(jīng)元的早期分化過程，而對分化晚期多巴胺神經(jīng)元的影響較小。但這一結(jié)論仍有待于體內(nèi)實驗中進(jìn)一步加以驗證。

綜上所述，有關(guān)Foxp1在mDAn早期發(fā)育中的具體功能以及Foxp1作為轉(zhuǎn)錄因子通過與何種靶基因結(jié)合以調(diào)節(jié)mDAn發(fā)育仍有待進(jìn)一步的研究。相關(guān)研究在完善mDAn發(fā)育的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制方面具有重要意義。