Atg5在肌萎縮側(cè)索硬化癥轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體和腦干中表達(dá)降低

劉金夢，管英俊*，陳燕春，劉永新，王巧真，周風(fēng)華，王箐

（濰坊醫(yī)學(xué)院，1臨床醫(yī)學(xué)院，2麻醉學(xué)系，濰坊 261053）

肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種慢性進(jìn)展性神經(jīng)退行性疾病，特征是皮層、腦干和脊髓等運動神經(jīng)元的選擇性和進(jìn)行性退化，臨床上出現(xiàn)進(jìn)行性肌無力、肌萎縮，最后導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡[1]。許多類型的神經(jīng)退行性疾病都伴隨著聚集的和泛素化蛋白的積累，自噬參與了聚集蛋白的降解和去除，自噬受到抑制會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)退行性疾病[2]。超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1, SOD1）基因突變與ALS發(fā)病密切相關(guān)[3]。研究表明，突變的SOD1聚集體會減弱溶酶體的逆向轉(zhuǎn)運，在ALS早期出現(xiàn)進(jìn)行性自噬溶酶體缺陷與清除受損[4]。本實驗室前期經(jīng)實驗證明SOD1G93A突變的ALS轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中多種自噬相關(guān)因子表達(dá)水平異常，如TFEB、beclin1、Atg4B[5,6]、Atg5[7]。Peng等[8]的研究也表明自噬相關(guān)基因Atg5在自噬體形成中十分重要。ALS脊髓自噬的研究很多，但對于紋狀體和腦干神經(jīng)元的研究尚不明確。本研究應(yīng)用SOD1G93A基因突變的ALS轉(zhuǎn)基因小鼠檢測Atg5在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體和腦干中的表達(dá)變化，以探究自噬與ALS的關(guān)系，為從自噬角度系統(tǒng)闡明ALS發(fā)病機(jī)制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 實驗動物

SOD1G93A基因突變的ALS轉(zhuǎn)基因小鼠，購自Jackson實驗室。將4w的小鼠剪尾0.2～0.4cm，按吳欣等方法[9]進(jìn)行基因型鑒定。將成年ALS轉(zhuǎn)基因小鼠根據(jù)發(fā)病早期（95d）、中期（108d）和晚期（122d）隨機(jī)分為3組，每組ALS轉(zhuǎn)基因小鼠配以同窩野生型（wide-type, WT）小鼠作為對照。

2 實驗試劑及儀器

Atg5兔單克隆抗體購自Cell Signaling公司，β微管蛋白III（β-tubulin III）小鼠多克隆抗體購自R&D，鼠抗GAPDH單克隆抗體購自Proteintech Group公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO公司，SYBR Premix Ex TaqII購自Takara公司；CFX96實時定量PCR儀購自Bio-Rad公司。

3 免疫熒光標(biāo)記

參照本實驗室的方法灌注固定，制備鼠腦冷凍組織切片[10]。實驗前冷凍切片常溫晾片2h，滴加10%山羊血清，37℃封閉抗原40 min，PBS清洗，滴加兔抗Atg5（1∶50）、鼠抗 β-tubulin Ⅲ（1∶100），4℃孵育過夜。PBS清洗，滴加Cy3標(biāo)記的羊抗兔和Alexafluor 488標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗（終濃度為1∶400），37℃避光孵育40min，滴加Hoechst，37℃孵育避光15min，防淬滅熒光封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察Atg5及β-tubulin Ⅲ表達(dá)情況。對照組用PBS代替一抗。

4 qRT-PCR

RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：參照本實驗室之前的方法提取RNA[10],根據(jù)TOYOBO公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書采用一步法行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，冰上配置反應(yīng)體系，2μg RNA，4μl 5×RT Buffer，1μl RT Enzyme Mix，1μl Primer Mix，Nuclease-free Water將體積補(bǔ)至 20μl，37℃、15min，98℃、5min，-20℃ 保存。

qPCR擴(kuò) 增 反 應(yīng)：Atg5上 游 引 物 5’ -TACAG-CATTTTCACAGAGAAGGACG- 3’，下游引物3’-CAGCATTGGCTCTATCCCGTG-5’；β-actin 上游引物 5’-CGTTGACATAAGTAAAGACC-3’，下游引物 3’ -ACAGTCCGCCTAGAAGCAC-5’。以 2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，β-actin上下游引物各0.8μl，Atg5上下游引物各 0.8μl，10μl SYBR，6.4μl DDW 配成反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：預(yù)變性，95℃，1min；PCR 反應(yīng)，95℃，15s，60℃，1min，共循環(huán)40次，最后生成融解曲線，結(jié)束反應(yīng)。

5 Western Blot

取ALS小鼠和野生型小鼠紋狀體和腦干，加裂解液后冰上充分勻漿，裂解30 min，4℃、12000 r/min離心15min，取其上清，檢測蛋白濃度。配制12% SDS-DAGE凝膠，每孔上樣40μl蛋白，先以恒壓80 V電泳40min，再以恒壓120V電泳60min，取出凝膠，恒流300mA、100min轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉抗原2h，PBS清洗PVDF膜，濾紙吸凈表面液體后孵育一抗 Atg5（1∶1000）、GAPDH（1∶2000），放置冰箱4℃過夜。常溫下孵育兔二抗（1∶10000）2h，PBS清洗后，ECL孵育后暗室膠片曝光。

6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用IPP6.0圖像分析軟件測量Western blot中的Atg5陽性條帶和GAPDH陽性條帶的光密度值，用SPSS20.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗分析結(jié)果，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

免疫熒光染色顯示，ALS小鼠和WT小鼠紋狀體和腦干內(nèi)舌下神經(jīng)核（hypoglossal nerve nucleus,12N）及面神經(jīng)核（facial nerve nucleus, 7N）內(nèi)均可檢測到Atg5陽性細(xì)胞，且與β-tubulin Ⅲ標(biāo)記的神經(jīng)元共表達(dá)。與WT小鼠相比，ALS小鼠紋狀體和腦干內(nèi)12N和7N中Atg5免疫陽性反應(yīng)明顯減弱（圖1，圖2）。

圖1 免疫熒光雙標(biāo)檢測108d ALS小鼠紋狀體內(nèi)Atg5的免疫反應(yīng)性變化。比例尺，20μmFig. 1 Expression change of Atg5 detected by immunofluorescence double staining in the striatum of ALS transgenic mice at day 108 after birth. Scale bar, 20μm

圖2 免疫熒光雙標(biāo)檢測108d ALS小鼠腦干舌下神經(jīng)核(12N)和面神經(jīng)核(7N) 中Atg5的免疫反應(yīng)性變化。比例尺，20μmFig. 2 Expression change of Atg5 detected by immunofluorescence double staining in the brainstem hypoglossal nerve nucleus (12N) and facial nerve nucleus (7N) of ALS transgenic mice at day 108 after birth. Scale bar, 20μm

qRT-PCR檢測顯示，與WT小鼠相比，ALS轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體中Atg5 mRNA在發(fā)病的早、中、晚期均顯著下降；腦干中Atg5 mRNA在發(fā)病中、晚期均顯著下降（圖3）。

圖3 ALS小鼠紋狀體（A）和腦干（B）中Atg5 mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR檢測的統(tǒng)計學(xué)分析；**，與WT小鼠相比，P＜0.01Fig. 3 Statistical analysis of Atg5 mRNA expression detected by qRT-PCR in the striatum (A) and brain stem (B) of ALS transgenic mice. **, P＜0.01,compared with WT mice

Western blot分析顯示，與WT小鼠比較，ALS小鼠紋狀體和腦干中Atg5蛋白在發(fā)病早期無顯著性變化，發(fā)病中、晚期表達(dá)均降低（圖4）。

圖4 ALS小鼠紋狀體（A）和腦干（B）中Atg5蛋白水平表達(dá)的Western blot檢測。A1和B1，代表性Western blot；A2和B2，Atg5蛋白水平的統(tǒng)計學(xué)分析；*，與WT小鼠相比，0.01＜P＜0.05Fig. 4 Western blot detection for the expression of Atg5 in the striatum (A) and brain stem (B) of ALS transgenic mice. A1 and B1, representative Western blots; B1 and B2, statistical analysis of Atg5 protein levels; *, 0.01＜P＜0.05, compared with WT mice

討 論

自噬是一種普遍存在于真核生物中的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)[12]，可以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、清除損傷的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)[13]。ALS是一種以受累運動神經(jīng)元中泛素化蛋白質(zhì)聚集為特征的神經(jīng)退行性疾病。1993年，SOD1是第一個被鑒定為在家族性ALS病例中聚集的突變蛋白[11]。ALS中SOD1基因突變導(dǎo)致的大量錯誤折疊蛋白質(zhì)聚集體需要自噬來清除。近年來的研究也表明自噬與ALS發(fā)病相關(guān)[14]。神經(jīng)元中Atg5或Atg7的選擇性遺傳消融導(dǎo)致與海馬、大腦和小腦皮質(zhì)中的神經(jīng)元喪失有關(guān)的運動和行為缺陷。在神經(jīng)元特異性自噬缺陷小鼠中觀察到的病理性改變與神經(jīng)退行性疾病患者中發(fā)現(xiàn)的相似，表明自噬是神經(jīng)元存活所必需的。自噬的遺傳缺失損害泛素-蛋白質(zhì)聚集體的分解，誘導(dǎo)泛素化蛋白質(zhì)在神經(jīng)元中的累積。在阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer’s disease，AD）、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）、亨廷頓?。℉untington’s disease，HD）中均有自噬功能障礙導(dǎo)致的蛋白質(zhì)錯誤聚集[12]。Zare-shahabadi等[15]研究也表明自噬-溶酶體缺陷在AD發(fā)病早期發(fā)生，并在疾病進(jìn)程中起重要作用。以上研究提示自噬改變與ALS等多種神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。

Atg5作為自噬家族中的一員，可與Atg12相結(jié)合，形成自噬體前體，誘導(dǎo)自噬，抑制Atg5的基因表達(dá)，自噬會受到抑制[10]。Atg5是高度保守的蛋白質(zhì)，Kim等證明了Atg5的純合E122 d突變（在兩個共濟(jì)失調(diào)的人類受試者中發(fā)現(xiàn)的獨特突變）導(dǎo)致綴合至Atg12的Atg5減少以及自噬活性的總體降低。完全敲除Atg5的小鼠在出生后不久即死亡，表明自噬對于哺乳動物的存活是必需的[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，ALS小鼠中Atg5 mRNA和蛋白在發(fā)病中、晚期均降低，免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，紋狀體和腦干中Atg5標(biāo)記的陽性細(xì)胞與神經(jīng)元存在共表達(dá)，提示自噬發(fā)生在神經(jīng)元。紋狀體和腦干均與運動功能有關(guān)，自噬是神經(jīng)細(xì)胞存活所必需的，Atg5表達(dá)下調(diào)，自噬的減弱，導(dǎo)致異常蛋白聚集體清除的減少，加劇神經(jīng)元的變性。神經(jīng)元是有絲分裂后的細(xì)胞，神經(jīng)元中易聚集的蛋白質(zhì)不易被降解，因此蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)的活性改變會引起蛋白質(zhì)的異常積累，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙[17]，最后可致神經(jīng)退行性疾病。Hu等[18]通過原位雜交、免疫熒光技術(shù)檢測與PD相關(guān)的自噬相關(guān)的基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Atg5的表達(dá)水平下降，自噬通量被阻斷。通過游泳行為分析發(fā)現(xiàn)Atg5下調(diào)導(dǎo)致PD斑馬魚模型病理性運動行為加重，酪氨酸羥化酶標(biāo)記的多巴胺能神經(jīng)元或多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白損失，阻斷斑馬魚模型中的自噬通量，表明Atg5對多巴胺能神經(jīng)元具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。

Atg5在ALS小鼠紋狀體和腦干中出現(xiàn)的異常變化，提示Atg5調(diào)控的自噬改變與ALS大腦紋狀體和腦干病變有關(guān)，干預(yù)自噬將為ALS提供新的治療途徑。近年來應(yīng)用自噬治療神經(jīng)退行性疾病越來越受到關(guān)注，上調(diào)自噬的藥物治療可能是一種有前景的ALS治療策略[19]。