心肌特異性導向肽靶向診療造影劑增強心肌分子顯影及其在大鼠體內的分布

趙雪麗，羅 文，王志剛，冉海濤，劉麗文*

(1.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院超聲科，陜西 西安 710032；2.重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所，重慶 400010)

液態(tài)氟碳納米探針是一種新型超聲造影劑，可在低強度聚焦超聲(low intensity of focused ultrasound， LIFU)作用下發(fā)生液—氣相變形成微泡，從而增強超聲顯像，并可通過LIFU激發(fā)促使納米探針相變至爆破，達到靶向釋藥目的，目前相關研究[1-4]多集中于對腫瘤的治療，針對心臟疾病的研究較少。心肌特異性導向肽(primary cardiomyocyte specific peptide， PCM)是由20個氨基酸(WLSEAGPVVTVRALRGTGSW)組成的肽段，與心肌細胞結合能力強[5]，將其連接于微球表面，可達到靶向心臟的效果。卡維地洛為非選擇性β受體阻滯劑，可用于治療心律失常、心肌肥厚及心力衰竭等[6-8]，但對其他組織器官存在較多不良反應。本研究以卡維地洛為模型藥物，利用PCM的主動靶向作用，并采用LIFU激發(fā)促使納米顆粒在靶部位爆破，使藥物聚集在心臟部位發(fā)揮作用，以期在增強超聲顯像效果的同時減少藥物不良反應，建立診斷和治療心臟疾病于一體的新型靶向載體。

1 材料與方法

1.1 主要藥物及試劑 卡維地洛、羧基端聚乳酸-羥基乙酸(PLGA-COOH，分子量1.2萬，聚合比為50∶50，濟南岱罡生物工程有限公司)，液態(tài)氟碳(全氟正戊烷PFP；Elfatochem公司)，聚乙烯醇(Poly-vinylalcohol， PVA；Sigma公司)，二氯甲烷(重慶川東化工有限公司)，MES緩沖液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS，Sigma公司)，DiI、DiR熒光染料(碧云天生物技術研究所)，PCM、FITC-PCM(上海吉爾生化有限公司)。

1.2 主要儀器 FA2004A電子天平(上海電子儀器有限公司)，XL2020聲振儀(HEATSYSTEM公司)，F(xiàn)J-200高速分散均質機(上海標本模型廠)，磁力攪拌器(IKA公司)，冷凍離心機(EPPENDORF公司)，馬爾文激光粒徑及電位檢測儀(Malvern公司)，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)，高校液相色譜儀(島津公司)，流式細胞儀(BD公司)，LIFU(重慶醫(yī)科大學超聲研究所自制)。

1.3 方法

1.3.1 制備載藥液態(tài)氟碳納米造影劑(雙乳化法) 稱取50 mg PLGA-COOH，加入5 mg卡維地洛，溶于2 ml二氯甲烷中，再加入200 μl PFP，冰浴聲振3 min(振動5 s，停止5 s)，取10 ml 4% PVA加入上述溶液，在高速均質機(10 000 r/min)中均質3 min，結束后加入適量2%異丙醇溶液，放入磁珠，在冰浴環(huán)境下磁力攪拌4～6 h；待有機溶劑完全揮發(fā)后，以雙蒸水多次洗滌，離心后獲得載藥納米粒，加入5 ml雙蒸水重懸。制備帶熒光納米粒時，在PLGA-COOH溶于二氯甲烷的同時加入微量染料DiI，其余步驟同前。整個過程避光操作，獲得非靶向納米造影劑(C-PFPs)。

1.3.2 制備PCM修飾的載藥液態(tài)氟碳納米造影劑(碳二亞胺法) 取上述C-PFPs造影劑溶液1 ml離心、洗滌，復溶于pH為6.0的MES緩沖液中，再加入一定量EDC和NHS(摩爾比EDC∶NHS=2∶1)，在4℃搖床上低溫孵育活化1 h；再以pH為8.0的MES緩沖液多次離心、洗滌，洗掉多余的EDC和NHS；向上述溶液中加入FITC-PCM肽并混勻，使摩爾比PLGA-COOH∶FITC-PCM=1∶1，繼續(xù)孵育10 h；再用MES緩沖液(0.1 mol/L，pH=8.0)漂洗離心3～5次，洗去未連接多肽；收集PCM靶向造影劑，分散溶解在MES的緩沖液(0.1 mol/L，pH=8.0)中，即獲得連接PCM的靶向微球納米造影劑(PCM/C-PFPs)。對照組不加EDC和NHS，其余步驟相同。

1.3.3 PCM/C-PFPs基本性質測定 采用光學顯微鏡和透射電鏡觀察PCM/C-PFPs的形態(tài)、大小及分布，以馬爾文激光粒徑電位儀測量其粒徑和Zeta電位。采用高效液相色譜儀分析PCM/C-PFPs的包封率，包封率(%)=實際藥物濃度/理論藥物濃度×100%。

1.3.4 PCM與C-PFPs的連接情況 以倒置熒光顯微鏡以及流式細胞儀觀察非靶向造影劑C-PFPs與多肽PCM的連接情況，所有步驟均避光操作。重復制備15個不同批次PCM/C-PFPs，包封率≥70%、PCM連接率≥90%為納米粒制備成功。

1.3.5 體外載藥造影劑熱致相變反應 將稀釋后的納米微球滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，并將其放于加熱板上加熱，記錄加熱時間及溫度，其間動態(tài)調節(jié)聚焦觀察納米粒相變產生微氣泡的過程。

1.3.6 LIFU激發(fā)后體內超聲顯影情況 將32只SD大鼠[許可證號SYXK(陜)2015-001]隨機分為4組，每組8只，即聲諾維組、PCM/C-PFPs+LIFU組、C-PFPs+LIFU組和單純PCM/C-PFPs組，分別經尾靜脈注射500 μl不同造影劑，除聲諾維組和單純PCM/C-PFPs組外，PCM/C-PFPs+LIFU組和C-PFPs+LIFU組大鼠均在注射后采用LIFU激發(fā)(3.2 W/cm2，10 min)，分別在激發(fā)后1、10、30、60 min超聲觀察大鼠心臟部位顯影情況，并以DFY軟件定量分析顯影聲強度(灰度值)。

1.3.7 PCM/C-PFPs大鼠和體內分布 將24只SD大鼠[許可證號SYXK(陜)2015-001]隨機分為3組，每組8只，即PCM/C-PFPs+LIFU組、C-PFPs+LIFU組和單純PCM/C-PFPs組，分別經尾靜脈注射DiI熒光標記納米造影劑。給藥 10 h后處死大鼠，取各組大鼠心臟及PCM/C-PFPs+LIFU組的其他主要器官組織(肝、腎、肺、脾)，-20℃下冰凍切片，多聚甲醛固定15 min，DAPI染色 10 min，封片后采用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標記納米粒在大鼠體內各組織內的分布情況。以Image-Pro plus 6.0成像軟件定量分析各組納米粒在體內的熒光強度。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以±s表示，多組間造影劑顯影聲強度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 載藥靶向診療探針PCM/C-PFPs的基本特性 PCM/C-PFPs納米造影劑為乳白色混懸液，光鏡下觀察為類圓形，形態(tài)規(guī)則，分布均勻，見圖1A；透射電鏡觀察納米粒呈球形，見圖1B；其平均粒徑為(415.00±6.24)nm，電位為(-20.27±1.55)mV，見圖2。藥物卡維地洛的包封率為(78.23±3.45)%。

2.2 多肽PCM與非靶向載藥納米探針C-PFPs的連接情況 倒置熒光顯微鏡觀察，C-PFPs與多肽PCM連接良好，連接率為(98.98±1.02)%，見圖3、4。15批次PCM/C-PFPs中，僅1個批次樣品不合格，包封率為65.40%，制備成功率為93.33%(14/15)。

2.3 體外熱致相變反應 加熱前納米探針穩(wěn)定，無相變，見圖5A；溫度達45℃時，納米探針開始變大，發(fā)生相變，見圖5B；持續(xù)加熱至60℃，納米造影劑體積變大，數(shù)量增多，并逐漸聚集最后破裂，見圖5C。

2.4 LIFU激發(fā)后大鼠體內顯影情況

2.4.1 顯影時間 體內顯影實驗結果顯示，聲諾維組和PCM-C/PFPs+LIFU組均能顯著顯影，但聲諾維組僅注射后1 min顯影，10 min時消失；PCM-C/PFPs+LIFU組在體內顯影信號可持續(xù)至1 h；C-PFPS+LIFU組僅有少量顯影，持續(xù)時間10 min；單純PCM-C/PFPs組納米粒無顯影，見圖6。

圖5 PCM/C-PFPs熱致相變反應(×200) A.加熱前； B.溫度到45℃時； C.加熱到60℃時

圖6 體內超聲顯影圖

2.4.2 顯影強度 LIFU激發(fā)1 min后，PCM-C/PFPs+LIFU組顯影強度明顯高于PCM-C/PFPs和C-PFPS+LIFU組、低于聲諾維組(P均<0.05)；LIFU激發(fā)10、30、60 min后，PCM-C/PFPs+LIFU組顯影強度明顯高于其他3組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見圖7。

2.5 靶向納米探針在大鼠體內分布情況 PCM-C/PFPs+LIFU組大鼠心臟組織的紅色納米探針明顯多于C/PFPs+LIFU組和單純PCM-C/PFPs組，見圖8A、8B；PCM-C/PFPs+LIFU組中，大鼠心臟的納米探針分布多于肝、腎、肺、脾組織，見圖8C、8D。

3 討論

本研究制備的納米造影劑是采用穩(wěn)定性強的PLGA高分子材料作為外殼，同時包裹增加其聲學反射性的液態(tài)氟碳，結合了兩種材料的優(yōu)點；相比于微泡造影劑，具有粒徑小、半衰期長、可聚集顯影、能穿過血管內皮、實現(xiàn)“組織染色”等優(yōu)勢[9-10]，且可在增強顯影的同時獲得靶向治療效果。目前心臟疾病如心肌肥厚、心功能衰竭、心肌梗死等已成為重要的致死原因[11-13]，針對心臟疾病診斷和治療的靶向探針是研究的熱點。液態(tài)氟碳造影劑能增強顯影效果，心肌導向肽PCM可提高探針的靶向性，使更多的納米粒聚集于心臟，有助于及早發(fā)現(xiàn)和治療心臟疾病。本研究結果顯示，PCM-C/PFPs+LIFU組大鼠心臟可見明顯的靶向納米探針紅色熒光，而單純PCM-C/PFPs組和C/PFPs+LIFU組心臟紅色納米粒較少，提示靶向納米粒能夠通過主動靶向(通過心肌導向肽PCM靶向)和被動靶向(通過LIFU激發(fā))的方式促進納米探針進入心肌細胞；而單純PCM-C/PFPs組大鼠心臟未顯示明顯紅色熒光，提示在僅有主動靶向而無被動靶向的情況下，納米粒不能大規(guī)模地聚集于心臟組織。宣吉晴等[14]制備攜帶精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD肽的聚乳酸/羥基乙酸(PLGA)納米粒超聲造影劑，大小均勻，在體外實驗中對大鼠肝癌細胞有較強的特異性親和力。

圖7 體內超聲顯影聲強柱形圖 (*:與同時間點其他各組比較，P<0.05)

圖8 納米探針在大鼠體內的分布情況 A.納米探針在心臟分布圖(×400)； B.納米探針在心臟的熒光定量柱形圖； C.PCM-C/PFPs+LIFU組大鼠肝、腎、肺、脾中納米探針分布圖(×400)； D.PCM-C/PFPs+LIFU組大鼠心臟、肝、腎、肺、脾中的熒光定量柱形圖 (DAPI為細胞核染色，Dil為納米粒染色，Merge為兩種熒光融合)

本研究以PFP作為包裹材料，其沸點僅29℃，在 37 ℃時未出現(xiàn)相變。研究[15]發(fā)現(xiàn)，PFP被PLGA材料包裹后，相變閾值會提高，粒徑越小，相變溫度越高。本研究所得的納米粒粒徑約(415.00±6.24)nm，相變溫度約為45℃，表明PCM-C/PFPs靶向心臟的過程中不會自發(fā)相變，可保證納米粒在體內的穩(wěn)定性。而液態(tài)氟碳納米粒通過LIFU輻照后可發(fā)生相變而形成微泡，增強超聲顯像。同時，相變形成的微泡在聲場作用下還可發(fā)生非慣性空化，直至破裂釋放出藥物；而未發(fā)生相變的載藥納米粒在心臟組織可緩慢釋放藥物，在增強顯影的同時實現(xiàn)被動靶向，以增強藥物的治療效果，減少不良反應。本研究選用的卡維地洛屬于脂溶性藥物[16]，可很好地溶解于有機溶劑，鑲嵌于納米微球殼后可減少藥物用量，提高增強超聲靶向藥物控釋的安全性及可行性。本研究包載卡維地洛的納米探針具有較高的包封率[(78.23±3.45)%]，可達到治療劑量，由此避免微泡載藥量低、穩(wěn)定性差缺點。

總之，本實驗成功制備了可在大鼠體內同時實現(xiàn)心臟靶向顯影和藥物釋放的PCM-C/PFPs納米探針。該載藥體系也可用于其他藥物或基因治療，為靶向診療心臟疾病提供了實驗基礎。