人胃癌雙標(biāo)細(xì)胞系及鼠原位模型的高效構(gòu)建

胡 皓， 王 敏， 吳開春

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)鏡中心，上海 200032； 2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院

胃癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，是第二大致死性腫瘤，5年生存率僅20%～30%[1-2]，僅次于肺癌。因此，胃癌的研究受到越來(lái)越多的重視。動(dòng)物模型作為腫瘤機(jī)制及治療研究的重要方法，在癌癥研究中具有重要地位,特別是腫瘤原位模型,因其更加貼近和模擬腫瘤原始生長(zhǎng)環(huán)境，相較其他模型具有獨(dú)特研究?jī)?yōu)勢(shì)和更廣闊的應(yīng)用范圍[3-4]。然而，由于胃是空腔臟器，又深植于組織內(nèi)部，構(gòu)造原位模型相對(duì)困難。以往報(bào)道的原位模型建立方法存在動(dòng)物死亡率高、操作時(shí)間長(zhǎng)、成瘤率低等問(wèn)題。本研究建立了一套簡(jiǎn)便的小鼠胃癌原位模型構(gòu)建方法。該方法可短時(shí)間內(nèi)高效制備胃癌原位模型，可為胃癌研究提供研究便利。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、動(dòng)物、試劑及儀器胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901，慢病毒包裝細(xì)胞HEK-293T由腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。6～7周齡雌性BALB/C小鼠購(gòu)自北京維通利華[SCXK(京)2011-0011]，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(軍)2007-020]。慢病毒構(gòu)建載體pWPT-GFP、pMD2.G、psPAX2、pLenti-CMV-Puro-LUC、Delta 8.9、VSVG購(gòu)自Addgene公司。DMEM及質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。Lipofectamin 2000購(gòu)自Invitrogen公司。Polybrene購(gòu)自Millipore公司。Puromycin購(gòu)自Sigma公司。D-luciferin購(gòu)自Caliper公司。體視顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司。小動(dòng)物成像儀為IVIS Kinetic小動(dòng)物成像系統(tǒng)。

1.2慢病毒包裝4×106293T于轉(zhuǎn)染前1 d鋪于10 cm平板，使用Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pLenti-CMV-Puro-LUC、Delta 8.9及VSVG。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞上清，保存于-80 ℃。感染SGC-7901前1 d將細(xì)胞鋪于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)量為5×105。將病毒上清與Polybrene(8 μg/ml)混合后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板在32 ℃條件下1 200×g離心90 min，提高感染率。48 h后加入帶有Puromycin篩選培養(yǎng)2周。將篩選出的陽(yáng)性克隆再次感染GFP病毒。GFP病毒的包裝質(zhì)粒為 pWPT-GFP、pMD2.G、psPAX2。感染及包裝過(guò)程同前。GFP感染后行流式細(xì)胞分選，選出陽(yáng)性克隆。至此構(gòu)建雙標(biāo)細(xì)胞系SGC-7901/FLUC/GFP。

1.3體外檢測(cè)SGC-7901/FLUC/GFP活性倍比稀釋法將SGC-7901/FLUC/GFP鋪于96孔板。培養(yǎng)液補(bǔ)足100 μl每孔。首先選取GFP濾光片組，行IVIS熒光成像。熒光成像后，移液器每孔加入3 μl 濃度為150 μg/ml的D-luciferin，行生物發(fā)光模式采集。采集信號(hào)強(qiáng)度使用Living Image軟件分析。

1.4原位模型建立8只6～7周齡小鼠使用異氟烷氣體麻醉后，與左正中旁線切開約0.5 cm的小切口，無(wú)齒頓頭鑷小心從腹腔內(nèi)取出胃。無(wú)菌紗布周圍保護(hù)。在體視顯微鏡下，選取胃體大彎側(cè)30 G注射器小角度進(jìn)針，緩慢推入含有5×105個(gè)SGC-7901/FLUC/GFP的細(xì)胞懸液約30 μl。棉簽輕壓注射口，防止溢出后，還納胃入腹腔(見圖1)。依序縫合腹膜及皮膚。術(shù)后皮膚碘伏消毒。小鼠給予含有復(fù)方去疼片的飲水3 d。飲水需每天更換以防變質(zhì)。

圖1快速原位模型構(gòu)建方法A：暴露胃；B：注射細(xì)胞；C：縫合

Fig1ProceduresoforthotopicgastricmodelA: exposure of stomach; B: injecting tumor cells; C: suture

1.5原位模型活體成像觀察造模小鼠3 d后給予D-luciferin 150 μg/ml。10 min運(yùn)動(dòng)后麻醉，置于IVIS成像暗室行生物發(fā)光成像。成像采集時(shí)間1 min。

1.6胃癌原位移植瘤的鑒定造模小鼠2周后，處死小鼠行冰凍切片及HE染色觀察造模情況，并拍照。

2 結(jié)果

2.1成功構(gòu)建胃癌雙標(biāo)細(xì)胞系SGC-7901/FLUC/GFP胃癌細(xì)胞SGC-7901經(jīng)2次慢病毒感染及篩選、流式分選后，得到了高表達(dá)熒光素酶Luciferase及綠色熒光蛋白GFP的雙標(biāo)細(xì)胞。通過(guò)生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)及熒光顯微鏡觀察，SGC-7901/FLUC/GFP可滿足后續(xù)在體觀察和分析的需要。MTT實(shí)驗(yàn)證明與親本細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)異(見圖2)。

2.2SGC-7901/FLUC/GFP生物活性分析倍比稀釋法將SGC-7901/FLUC/GFP鋪于96孔板，放入IVIS成像系統(tǒng)后，行熒光成像和生物發(fā)光成像。成像結(jié)果與定量分析表明，熒光信號(hào)和生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目呈線性正相關(guān)(R2=0.9667，r2=0.9110)。結(jié)果提示，生物發(fā)光及熒光信號(hào)強(qiáng)度可作為提示腫瘤細(xì)胞數(shù)量的標(biāo)志(見圖3)。

圖2胃癌雙標(biāo)細(xì)胞系SGC-7901/FLUC/GFP的構(gòu)建A：熒光顯微鏡觀察(100×)；B：生物發(fā)光圖像；C：MTT實(shí)驗(yàn)

Fig2Establishmentofdouble-labeledgastriccancercelllineSGC-7901/FLUC/GFPA: fluorescent microscopy (100×);B: bioluminescence imaging； C: MTT assay

2.3小鼠原位模型構(gòu)建及監(jiān)測(cè)小鼠原位胃癌模型構(gòu)建后，第3天采用生物發(fā)光成像觀察體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況。8只小鼠均可見生物發(fā)光信號(hào)，成瘤率100%(見圖4)。生物信號(hào)未提示腹腔內(nèi)種植。生物發(fā)光信號(hào)可用于長(zhǎng)時(shí)間活體觀測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。通過(guò)定量分析可大致判斷體內(nèi)腫瘤載量。

2.4胃癌原位模型的組織學(xué)分析2周后處死造模小鼠，觀察造模情況。腫瘤呈現(xiàn)外生性生長(zhǎng)表現(xiàn)。HE染色和冰凍切片結(jié)果顯示，腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)良好，癌細(xì)胞呈巢樣生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)一致,核深染(見圖5)。

3 討論

早在1969年,RYGAARD等[5]就首次成功創(chuàng)建了人類腫瘤裸鼠皮下移植模型。然而隨著人們研究的深入，發(fā)現(xiàn)皮下移植瘤脫離了腫瘤生長(zhǎng)的原發(fā)部位，并不能真實(shí)模擬腫瘤在原位的生物學(xué)行為和特點(diǎn)。而采用原位建模的方式則盡可能貼近腫瘤原發(fā)部位的環(huán)境[6]。

圖3 SGC-7901/FLUC/GFP成像分析 A～B：生物發(fā)光成像及其線性分析；C～D：熒光成像及其線性分析Fig 3 Imaging evaluation of SGC-7901/FLUC/GFP A-B: bioluminescence imaging and its linear analysis; C-D: fluorescent imaging and its linear analysis

圖4 原位胃癌模型生物發(fā)光檢測(cè)Fig 4 Bioluminescence imaging of orthotopic gastric cancer

在胃癌原位模型的移植方法中，F(xiàn)URUKAWA等[7-8]報(bào)道的掛線法是將新鮮的腫瘤組織塊直接縫掛在漿膜層損傷的胃壁上。在此基礎(chǔ)上，近年又發(fā)展出荷包縫合法、OB膠、三維組織移植法等[9-12]。掛線法一方面需要將漿膜劃開，造成鼠胃不必要損傷、出血。另一方面，縫合不善易導(dǎo)致瘤組織脫落入腹腔，造成腹腔種植，降低成瘤率[9]。而荷包法因?yàn)樾枰^為復(fù)雜的手術(shù)技術(shù)，因而操作時(shí)間較長(zhǎng)，不易掌握。無(wú)論是掛線法、荷包法，還是OB法，均是腫瘤組織在漿膜外生長(zhǎng)，與腫瘤真實(shí)情況不同。而本研究報(bào)道的懸液注射法，操作方法簡(jiǎn)單，建模時(shí)間短，同時(shí)克服了以往報(bào)道[8,13]成瘤率低的問(wèn)題。

圖5 胃癌原位實(shí)體瘤組織分析 A：原位腫瘤生長(zhǎng)情況；B：離體胃；C：HE染色分析(40×)；D：冰凍切片觀察GFP+腫瘤生長(zhǎng)(40×)Fig 5 Histological analysis of orthotopic gastric cancer A: anatomical view of the gastric cancer; A: location of the tumor on stomach; B: HE stain (40×); C: frozen section showed GFP+tumor (40×)

小動(dòng)物成像技術(shù)是采用分子成像技術(shù)對(duì)各種生物學(xué)變化進(jìn)行定量、定性分析的新方法。小動(dòng)物活體成像技術(shù)可以獲得動(dòng)態(tài)、直觀圖像，同時(shí)非侵入性方法極大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[14]。本實(shí)驗(yàn)采取的生物發(fā)光技術(shù)因其可以實(shí)現(xiàn)深部組織成像，可以非常方便地用于評(píng)價(jià)原位腫瘤建模是否成功，以及觀測(cè)腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)[15-16]。我們前期研究[6]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在原位移植模型構(gòu)建當(dāng)天即可行生物發(fā)光成像用以判斷是否構(gòu)建成功。對(duì)于無(wú)生物發(fā)光標(biāo)記的其他胃癌細(xì)胞系，如BGC-823、MKN-28等，我們用上述方法同樣可以構(gòu)建成功。提示本方法具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

實(shí)驗(yàn)方案中也可采用靜脈麻醉，如常用的水合氯醛、戊巴比妥鈉、氯胺酮等。使用液體法的好處是造模中可防止長(zhǎng)時(shí)間氣體麻醉劑對(duì)手術(shù)人員造成的潛在損傷。但液體麻醉劑量應(yīng)嚴(yán)格控制，避免麻醉過(guò)量造成小鼠死亡。手術(shù)過(guò)程中及術(shù)后可使用保溫裝置，防止小鼠低體溫死亡及提高蘇醒率。此外，在注射瘤細(xì)胞過(guò)程中應(yīng)緩慢進(jìn)針，進(jìn)針深度不易過(guò)深，如誤將瘤細(xì)胞注射入胃腔則會(huì)導(dǎo)致造模失敗。造模過(guò)程中應(yīng)盡量防止細(xì)胞懸液外溢進(jìn)入腹腔，避免潛在腹腔種植[17]。

本研究所報(bào)道的胃癌原位模型構(gòu)建方法有以下特點(diǎn)：(1)操作步驟簡(jiǎn)單，無(wú)復(fù)雜的手術(shù)操作步驟，不需要特別的儀器設(shè)備，便于廣大研究人員借鑒和掌握；(2)成瘤率高，成瘤率近100%；(3)建模時(shí)間短，適合大量、高效制備胃癌原位模型。因此，本方法是腫瘤機(jī)制研究及抗腫瘤藥物篩選的良好平臺(tái)及載體。