大米中硒的有機(jī)形態(tài)及其生物利用度研究

龔如雨 張寶軍,2 艾春月 程祥磊

(江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院1，南昌 330006) (陸地表層格局與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所2，北京 100101)

硒是人體必需的微量元素之一。它主要通過(guò)食物鏈途徑進(jìn)入人體，且硒對(duì)人體健康具有重要的生理功能[1-2]。環(huán)境硒不僅有利于預(yù)防大骨節(jié)病等硒缺乏性疾病的發(fā)生和流行[3]，而且，適量硒的攝入對(duì)人群健康長(zhǎng)壽非常有益。已有研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)土壤硒含量與人口長(zhǎng)壽指數(shù)之間具有顯著的正相關(guān)關(guān)系[4]，特別是食物中總硒含量較高對(duì)人群健康長(zhǎng)壽作用明顯[5-6]。

目前，超過(guò)60%的中國(guó)居民以大米為主食[14]。特別是南方地區(qū)，大米在普通居民膳食中所占的比例更高。通常，食物中有機(jī)硒的生物利用度高于無(wú)機(jī)硒，因而，有必要對(duì)大米中有機(jī)硒的賦存狀態(tài)進(jìn)行深入研究。已有研究表明，有機(jī)硒占大米總硒的80%左右(78.4%～89.1%)[15-16]，且主要與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。例如，周鑫斌等[17]利用(NH4)2SO4溶液提取的富硒大米蛋白硒約占有機(jī)硒的43.07%～51.65%。這與富硒大米中谷蛋白硒占有機(jī)硒的比例(53.40%)基本相當(dāng)[16]。而張濤等[18]研究發(fā)現(xiàn)富硒大米中蛋白硒占有機(jī)硒的比例為84%，其中，谷蛋白硒約占總蛋白硒的57.1%。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，富硒大米谷蛋白酶解后主要以硒代蛋氨酸(SeMet)為主(52.3%)[19]。

上述內(nèi)容主要對(duì)富硒大米硒的含量、形態(tài)及硒的生物利用度進(jìn)行了研究，而對(duì)普通大米有機(jī)硒的賦存狀態(tài)及其對(duì)人體硒的吸收利用研究較少。因而，本實(shí)驗(yàn)擬以江西省典型長(zhǎng)壽區(qū)——宜春市溫湯鎮(zhèn)[20]普通種植的大米為研究對(duì)象，分析大米總硒、有機(jī)硒、谷蛋白硒及其吸收形態(tài)等含量特征，探討大米生物可利用硒與不同有機(jī)硒形態(tài)之間的相關(guān)關(guān)系，為深入了解大米硒在人體健康長(zhǎng)壽中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

根據(jù)研究區(qū)域的人口分布、土壤條件、種植的水稻品種、田間管理方法等情況，本研究選取了彭坊村、謝坪村、下鞏村等8個(gè)代表性自然村，并于2017年6月進(jìn)行了大米樣品的采集。所有樣品均為當(dāng)?shù)鼐用裆弦荒曜约曳N植后收獲的大米(已脫殼未拋光)。每村采集2 ～ 3份樣品，每份約200 g左右，共計(jì)20份。采集的大米樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后除去霉粒及未脫殼的米粒，于60 ℃恒溫干燥箱烘至恒重，用瑪瑙研缽磨碎裝入干凈的自封袋，置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2 儀器與試劑

SA-20原子熒光形態(tài)分析儀：北京吉天儀器有限公司；5 μm，4.6 × 250 mm C18柱：Aglient；TU-1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；S36 數(shù)顯消解裝置：北京萊伯泰科儀器有限公司；SHA-C 恒溫水浴震蕩器：江蘇金壇市中大儀器廠；H/T16MM 臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；GZX-9140MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HC-280T2 高速粉碎機(jī)：永康綠可食品機(jī)械有限公司等。

甲醇(CH3OH)、磷酸氫二銨[(NH4)2HPO4]、四丁基溴化銨(C16H36NBr，TBAB)均為色譜純：阿拉丁有限公司；胃蛋白酶(酶活力≥1 200 U/g)、胰蛋白酶(酪蛋白轉(zhuǎn)化力≥25)、淀粉酶(酶活力≥2 000 U/g)和豬膽鹽(≥60%)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白(≥98.0%)：美國(guó)Amresco公司；亞硒酸鹽[Selenite，Se(IV)]、硒酸鹽[Selenate，Se(VI)]、SeMet和硒代胱氨酸(Selenocystine，SeCys2)標(biāo)準(zhǔn)溶液：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院(北京)。高氯酸(HClO4)等均為優(yōu)級(jí)純。

1.3大米總硒及有機(jī)硒含量測(cè)定

大米總硒含量測(cè)定：稱(chēng)取0.5 g已磨碎的大米粉于50 mL消解管中，分別加入1 mL HClO4和5 mL HNO3，放置6 h后在電熱板上加熱(≤150℃)消解。當(dāng)消化管上部冒白煙，且消化液呈無(wú)色透明或略帶黃色時(shí)繼續(xù)消解至余液為1 mL左右。冷卻并加入1 mL濃HCl持續(xù)加熱(≤90℃)30 min，最后，將液體轉(zhuǎn)移至15 mL刻度離心管后用去離子水定容至10 mL待測(cè)。

大米有機(jī)硒含量測(cè)定：使用透析袋法[16-17]。稱(chēng)取1.5 g大米粉置于截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 u的透析袋中。然后，用1 L去離子水持續(xù)透析24 h(每6 h換水一次)，結(jié)束后將袋內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至消解管中進(jìn)行消解，步驟同上。大米總硒和有機(jī)硒含量均使用原子熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 大米蛋白質(zhì)的提取及硒含量的測(cè)定

稱(chēng)取10.0 g大米粉置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL NaOH溶液(7.5 × 10-2mol/L)水浴(40 ℃)震蕩4 h，離心(3 000 r/min)30 min后將上清液轉(zhuǎn)移至離心管并定容至50 mL。取1 mL溶液用于大米中蛋白質(zhì)的測(cè)定[21]。剩余溶液用30%(V/V)HCl調(diào)節(jié)pH為5.5，5 000 r/min離心15 min后產(chǎn)生的沉淀即為谷蛋白。谷蛋白的消解和硒含量測(cè)定同1.3，測(cè)定的含硒量即為谷蛋白硒。

1.5 大米硒的生物利用度及谷蛋白硒的形態(tài)分析

胃腸體外模擬實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[22]并略作修改：稱(chēng)取2.0 g大米樣品于50 mL離心管，加入5 mL模擬胃液(1%m/V胃蛋白酶，0.15 mol/L NaCl，pH=2.0)，水浴(37 ℃)振蕩4 h后用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH為7.5；然后，加入5 mL模擬腸液(3%m/V胰酶、1.5%m/V淀粉酶和1%m/V膽鹽，0.15 mol/L NaCl)，再水浴(37 ℃)振蕩4 h；最后，將模擬消化液離心(3 000 r/min，30 min)、分離、定容，測(cè)定總硒并分析硒形態(tài)。由于大米樣品總硒含量不高，因此，本研究?jī)H對(duì)1.4提取出來(lái)的谷蛋白進(jìn)行了胃腸模擬實(shí)驗(yàn)。

上述谷蛋白消化液過(guò)孔徑為0.45 μm濾膜后直接上機(jī)(SA-20)測(cè)定硒形態(tài)。流動(dòng)相的組成為3.0×10-2mol/L (NH4)2HPO4、5.0 × 10-4mol/L TBAB和2%V/VCH3OH，其流速為1 mL/min。硒標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的進(jìn)樣量均為400 μL，Se(IV)、Se(VI)、SeMet和SeCys2的線性范圍分別為0～53.6 μg/L、0～51.9 μg/L、0～49.3 μg/L和0～55.3 μg/L，其檢出限分別為0.964、0.802、1.276、1.030 μg/L。

1.6 統(tǒng)計(jì)與制圖

本研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和圖件制作分別使用SPSS 12.0和SigmaPlot 12.5完成。

2 結(jié)果

2.1大米總硒及有機(jī)硒含量特征

總體上，大米硒的算術(shù)均值為28.01±5.69 μg/kg(21.78～41.44 μg/kg)(圖1)。這一結(jié)果高于其他長(zhǎng)壽區(qū)谷物中硒的含量(16～20 μg/kg)[23]，略高于全國(guó)大米硒的平均水平(25 μg/kg)[15]。根據(jù)中國(guó)《富硒稻谷》標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 22499—2008)，所有樣品中僅有1份大米的硒含量(41.44 μg/kg)在40～300 μg/kg之間，屬于富硒大米。

除個(gè)別大米的有機(jī)硒含量較低(13.49 和14.94 μg/kg)外，其他樣品的有機(jī)硒含量均分布于18.08～29.80 μg/kg范圍內(nèi)(圖1)。而且，大米有機(jī)硒與總硒含量之間具有顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.64，P<0.01)(表1)。從有機(jī)硒占大米總硒的比例來(lái)看，其算術(shù)平均值為78.67±13.52%(54.05%～96.41%)。可見(jiàn)，大米中的硒絕大部分以有機(jī)硒的形式存在。

圖1 大米總硒及有機(jī)硒含量

2.2 大米谷蛋白硒及其主要硒形態(tài)

大米蛋白質(zhì)平均約占大米總質(zhì)量的9.44±1.03%(7.68%～11.73%)。其中，大米谷蛋白硒的平均值為11.52±2.11 μg/kg(8.68～15.95 μg/kg)(圖2)，它占大米有機(jī)硒的比例為53.73±8.27%(42.09%～81.22%)。而且，大米谷蛋白硒與有機(jī)硒含量之間具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.775，P<0.01)(表1)。雖然大米蛋白僅占大米總重的10%左右，但是，其中的谷蛋白硒仍是大米有機(jī)硒的主要存在形式。

大米谷蛋白酶解后僅有SeMet被檢出。如圖2所示，SeMet含量的波動(dòng)范圍為4.59～12.31 μg/kg，其平均值為7.56±2.31 μg/kg。同時(shí)，SeMet與大米谷蛋白硒含量之間具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.68，P<0.01)(表1)。從SeMet占大米谷蛋白硒含量的比例來(lái)看，除個(gè)別樣品SeMet比例稍低(37.78%)或稍高(分別為90.00%和99.39%)外，其余樣品均在49.53%～81.45%范圍內(nèi)變動(dòng)。由此可知，大米谷蛋白是SeMet的主要來(lái)源。

圖2 大米谷蛋白硒及SeMet含量

2.3 大米硒的生物可利用度

經(jīng)胃腸體外模擬后，大米粉消化液中各種形態(tài)硒的總量為15.41±3.68 μg/kg(9.95～24.94μg/kg)，占大米總硒的55.58±10.53%(34.81%～71.02%)，即為大米硒的生物利用度。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，體外模擬消化液中可被人體吸收利用的硒與大米各種硒結(jié)合形態(tài)特別是有機(jī)硒含量之間均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，其相關(guān)系數(shù)從大到小依次為：有機(jī)硒>谷蛋白硒>總硒>SeMet(表1)。

表1 大米生物可利用硒與總硒及不同有機(jī)硒組分的相關(guān)系數(shù)

注：**表示在0.01水平上顯著相關(guān)；*表示在0.05水平上顯著相關(guān)。

3 討論

上述結(jié)果表明：大米中有80%左右(78.67±13.52%)的硒以有機(jī)形式存在，其中，谷蛋白硒占大米有機(jī)硒的一半以上(53.73±8.20%)。這與方建軍等[16]和周鑫斌等[17]關(guān)于富硒大米中蛋白硒占有機(jī)硒比例的研究結(jié)果(分別為47.96%和53.40%)基本一致。然而，谷蛋白硒比例與大米有機(jī)硒含量則具有明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.509，P<0.05)。這可能與水稻生長(zhǎng)期間土壤-水稻系統(tǒng)無(wú)機(jī)硒的有機(jī)轉(zhuǎn)化效率及大米蛋白對(duì)硒的富集能力(蛋白硒/蛋白質(zhì)比例)等有關(guān)。已有研究表明，雖然發(fā)芽糙米中的總硒、有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒含量隨著浸泡液外源Se(IV)處理濃度的升高均有所增加，但是，無(wú)機(jī)硒的有機(jī)轉(zhuǎn)化率與硒濃度成負(fù)相關(guān)關(guān)系[24]。此外，不同類(lèi)型的大米蛋白對(duì)硒的富集能力也存在較大差異：醇溶蛋白(36.7)>球蛋白(9.3)>白蛋白(3.6)>谷蛋白(3.0)[10]。特別是醇溶蛋白中較多的硫代氨酸基酸使其富集硒的效率(約為70%)明顯高于谷蛋白(約為60%)[25]。

生物可利用硒與大米各部分有機(jī)硒含量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，雖然它與有機(jī)硒、谷蛋白硒、總硒和SeMet均具有顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，但是，大米生物可利用硒與SeMet的相關(guān)系數(shù)最小，僅為0.55(表1)。這是因?yàn)镾eMet除來(lái)自大米谷蛋白外還有可能來(lái)自大米中其他類(lèi)型的蛋白質(zhì)。有研究表明，雖然谷蛋白硒是大米蛋白硒最重要的組成部分(57.1%)，但是也存在一定比例的球蛋白(10.7%)、清蛋白(15.5%)、醇溶蛋白(16.7%)硒形式[18]。因此，未來(lái)有必要對(duì)大米中其他蛋白硒的組成及其代謝硒形態(tài)進(jìn)行深入研究。

雖然長(zhǎng)壽區(qū)大米的總硒水平并不高(28.01±5.69 μg/kg)，但谷蛋白硒中SeMet的比例(65.63%)明顯高于其他學(xué)者的研究結(jié)果(31.3%[10]和52.3%[19])。SeMet通常占大米總硒的82.0%～96.0%[11,26-27]，它主要通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸方式被機(jī)體吸收并參與各種蛋白的構(gòu)成[28]。更為重要的是，人體對(duì)食物中SeMet的生物利用效率要高于其他硒形態(tài)[29]，且SeMet對(duì)提高機(jī)體抗氧化及免疫能力明顯高于Se(IV)、Se(VI)等無(wú)機(jī)硒[28]。例如，與Se(IV)相比，SeMet更能提高奶牛血清中谷光甘肽過(guò)氧化物酶和超氧岐化酶的活性[30]和雞的免疫應(yīng)答能力[31]。與此同時(shí)，SeMet比無(wú)機(jī)硒[(Se(IV)和Se(VI)]更能緩解重金屬鎘(Cd)對(duì)細(xì)胞造成的DNA損傷[32]。因此，當(dāng)?shù)鼐用竦慕】甸L(zhǎng)壽很可能與大米谷蛋白中SeMet比例較高且其生物效應(yīng)明顯有密切的關(guān)系。

4 結(jié)論

典型長(zhǎng)壽區(qū)大米中有機(jī)硒的比例為78.67%±13.52%，且主要以谷蛋白硒的形式存在(53.73%±8.27%)。雖然大米硒的生物可利用度(55.58%±10.53%)并不算很高，但是，大米谷蛋白中易于被人體吸收利用的SeMet比例相對(duì)較高(65.30%±15.54%)，因而，當(dāng)?shù)鼐用竦慕】甸L(zhǎng)壽可能與此有較為密切的關(guān)系。此外，鑒于谷蛋白硒僅占大米有機(jī)硒的一半左右，未來(lái)有必要對(duì)其他蛋白硒的代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入研究。