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    QUARTET突變四倍體擬南芥的獲得與表型分析

    2018-08-18 01:44:20何碩康羅澤偉
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年7期
    關(guān)鍵詞:多倍體四倍體二倍體

    何碩康 羅澤偉

    (復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物統(tǒng)計(jì)所,上海 200433)

    多倍化(Polyploidy)即生物體合子中擁有超過兩套染色體的現(xiàn)象,廣泛存在于自然界中,如魚類[1]、甲殼類[2]以及兩棲類[3]。植物中多倍化現(xiàn)象更是普遍存在。80%以上的被子植物在進(jìn)化過程中存在多倍性[4]。以多倍體形式存在的物種有更豐富的基因型與表型多態(tài)性,進(jìn)而提高對環(huán)境的適應(yīng)性與群體遺傳多態(tài)性[5]。此外,多倍化也是產(chǎn)生與保持雜種優(yōu)勢的重要途徑之一[6]。根據(jù)多倍體中染色體組的遺傳來源,可將多倍體分為同源多倍體(Autopolyploid)與異源多倍體(Allopolyploid)[7]。

    多倍化會對細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生深刻的影響[8]。在多倍體減數(shù)分裂過程中,既有可能染色體之間兩兩交叉形成二價(jià)體,染色體行為類似于二倍體,這種模式被稱為二體遺傳;也有可能超過兩條同源染色體或近源染色體之間交叉形成多價(jià)體,這種模式被稱為多體遺傳,這導(dǎo)致多倍體遺傳要比二倍體遺傳復(fù)雜很多[9]。目前對于多倍體遺傳的研究都是建立在群體數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上。即利用兩套背景不同、具有多態(tài)性標(biāo)簽位點(diǎn)的染色體構(gòu)建雜合同源或異源多倍體親本,然后對其后代回交或自交群體采集一定大小的樣本,進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)的檢測并繪制圖譜,統(tǒng)計(jì)分析[10]。實(shí)際上,群體數(shù)據(jù)的分析是極其依賴模型的,依據(jù)的模型不同所得結(jié)果常有較大差異[11,12]。但目前多是利用理論分析與計(jì)算機(jī)模擬的方法建模,而沒有一個(gè)由準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的模型。因此我們希望利用四分子分析,這一能夠精準(zhǔn)分析單次減數(shù)分裂的方法[13],將多倍體遺傳重組的研究從群體水平精確到個(gè)體水平,構(gòu)建有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的多倍體遺傳重組模型。20世紀(jì)90年代以來,在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的3個(gè)基因[14,15],這3個(gè)基因任意一個(gè)的純合失活突變都能使花粉母細(xì)胞單次減數(shù)分裂發(fā)育而來的4個(gè)花粉互不分離,并由此將這3個(gè)基因命名為QUARTET(QRT1、QRT2以及QRT3),是應(yīng)用四分子分析的極好材料。因此本研究從帶有qrt1突變的二倍體擬南芥Columbia及Landsberg erecta生態(tài)型出發(fā),誘導(dǎo)并篩選染色體組成功加倍的四倍體qrt1突變株,并測定它們與二倍體及四倍體參照的表型差異,能為在多倍體遺傳重組中應(yīng)用四分子分析奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    野生型Columbia生態(tài)型二倍體Col-0及其四倍體CS3151、野生型Landsberg erecta生態(tài)型二倍體Ler及其四倍體CS3900均為實(shí)驗(yàn)室保存。二倍體Columbia QRT1 -/- 突變體、二倍體Landsberg erecta QRT1 -/- 突變體以及特異性識別 擬南芥(Arabidopsis thaliana)著絲粒位置180 bp重復(fù)序列的熒光原位雜交探針獲贈于陸平利研究員(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院植物科學(xué)研究所)。

    1.2 方法

    1.2.1 擬南芥的誘導(dǎo)與傳代 用0.08%濃度的秋水仙素溶液處理10 d齡的QRT1 -/- 二倍體Columbia與Landsberg erecta幼苗(G0)5 h。培養(yǎng)G0幼苗,收集G0的種子。將這批種子種下,從這批苗(G1)中鑒定與篩選成功加倍的植株,收集這些植株的種子,傳代,并于后代中再次驗(yàn)證倍性。

    1.2.2 流式細(xì)胞技術(shù) 取50 mg左右植株幼嫩蓮座葉片,參照文獻(xiàn)[16]處理。不同的是,這里葉片材料經(jīng)過破碎之后經(jīng)過30 μm孔徑尼龍膜過濾,并用100 μg/mL的碘化丙啶(PI)染色30 min左右。所用儀器為FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD Biosciences),分析軟件為CellQuestPro。所用熒光染料為PI,選擇熒光檢測通道為FL2,同時(shí)對FL-2的值取對數(shù),使等比DNA含量的峰在圖上顯示為等間距的峰。

    1.2.3 熒光原位雜交技術(shù) 取卡諾氏液固定好的幼嫩花序,按照前人方式[17]處理,觀察其中花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂。DNA染料為4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),同時(shí)利用特異性識別擬南芥著絲粒位置180 bp重復(fù)序列的熒光原位雜交探針標(biāo)識著絲粒的位置,進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。熒光探針生色基團(tuán)為Cy3,識別序列以及制作過程參照文獻(xiàn)進(jìn)行[18]。

    2 結(jié)果

    2.1 四倍體的誘導(dǎo)與流式細(xì)胞儀檢測倍性結(jié)果

    本研究中,為確定細(xì)胞倍性,利用流式細(xì)胞技術(shù),以二倍體野生型Col與Ler(圖1-A,1-B)、四倍體野生型Col與Ler(圖1-G,1-H)為對照,從Columbia背景篩選出并編號為C313的植株(圖1-C),從Ler背景篩選出并編號為L311的植株(圖1-D)。自交傳代,并在G3中再次用流式細(xì)胞技術(shù)驗(yàn)證C313與L311的倍性(圖1-E,1-F)。

    本研究中的流式結(jié)果,顯示了擬南芥中廣泛存在的內(nèi)復(fù)制現(xiàn)象[19],即核基因組復(fù)制而細(xì)胞不分裂的現(xiàn)象。這導(dǎo)致擬南芥葉片實(shí)際為多種倍性細(xì)胞共存的嵌合體,故其流式結(jié)果中有多個(gè)峰。而由于熒光強(qiáng)度取了對數(shù),故等比的峰表現(xiàn)為等間距的峰。而二倍體與四倍體的區(qū)別就在于,二倍體有2n的峰(圖1-A,1-B),而四倍體沒有(圖1-G,1-H)。經(jīng)過G1與G3的重復(fù)驗(yàn)證,流式結(jié)果驗(yàn)證C313與L311核基因組加倍成功。另外,有文章[20]報(bào)道擬南芥的內(nèi)復(fù)制速率隨著倍性的提高而提高,在本研究中,也基本反映了這一現(xiàn)象(圖1-C,1-E,1-F,1-G,1-H),在這幾張圖中,4n的峰相比于二倍體中2n的峰(圖1-A,1-B)要更低,而內(nèi)復(fù)制之后的峰相對的更高,表現(xiàn)出更高的內(nèi)復(fù)制速率。

    圖1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞倍性

    2.2 熒光原位雜交技術(shù)鑒定倍性結(jié)果

    在利用流式初步在G1群體中篩選出C313與L311植株后,于花期觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂(圖2-d-i)。在細(xì)線期,細(xì)胞已完成DNA復(fù)制,染色體開始凝聚。此時(shí)姐妹染色單體通過著絲粒相連,尚未分開。而同源染色體尚未配對。因此染色質(zhì)彌散于核內(nèi),每一個(gè)著絲粒都代表一條染色體,代表其上的一對姐妹染色單體??梢奀313與L311中皆能數(shù)到20個(gè)點(diǎn),而二倍體對照(圖2-a-c)只能數(shù)到10個(gè)點(diǎn),驗(yàn)證了倍性。并繼續(xù)傳代,至G3時(shí),再次觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂(圖2-j-p),驗(yàn)證了C313與L311染色體加倍成功。

    圖2 熒光原位雜交技術(shù)檢測細(xì)胞倍性

    2.3 營養(yǎng)生長相關(guān)表型的測定與分析

    2.3.1 倍性對主根及側(cè)根生長的影響 利用垂直平板培養(yǎng)記錄種子萌發(fā)期根的生長,包括縱向深度(主根長度)和橫向廣度(測根數(shù)目)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Col與Ler背景中,多倍化都不對主根的生長造成影響,而qrt1突變在Ler中對主根生長有抑制作用(圖3-A-C),p=2.2e-16)。至于側(cè)根,多倍化以及qrt1突變在兩個(gè)被背景中都會抑制側(cè)根數(shù)目,而在Ler中,多倍化及qrt1突變的抑制作用顯現(xiàn)出一定的可加性,而在Col中則沒有(圖3-D,E)。

    圖3 根的相關(guān)表型

    2.3.2 倍性對莖的影響 與一般多倍化導(dǎo)致植株體型增大的報(bào)道不同,本研究中發(fā)現(xiàn)倍性對主莖高度的影響具有背景依賴性(圖4-C)),即在Col中,四倍體更高(37.72 cm增長至41.41 cm,p=2.06e-17),而在Ler中,四倍體更矮(33.52 cm降低至31.56 cm,p=2.50e-10),也許是由于樣本量(30株)不夠大導(dǎo)致的。同時(shí),四倍體中主莖抽薹日期也被推遲(圖4-D),Col中由26.2 d推遲至39.0 d,Ler中由24.6 d推遲至35.0 d)。至于分枝,我們又分了兩個(gè)表型,一個(gè)是近蓮座的基部側(cè)枝(類似于分蘗),一個(gè)是距離土壤有一定高度的主莖分枝。多倍化僅僅在Ler背景中抑制了主莖分枝的數(shù)量,在Col背景中則無影響(圖4-B)。而對于基部側(cè)枝這個(gè)表型,不管是多倍化還是qrt1突變,都具有顯著的抑制效果,同時(shí)二者抑制作用可疊加(圖4-A)。實(shí)際上,在四倍體主莖基部,可以觀察到未生長的芽,所以四倍化抑制基部側(cè)枝數(shù)目主要是通過抑制芽的生長而不是芽的發(fā)生。

    2.3.3 倍性促進(jìn)葉的初生生長 至于對葉的影響,在兩個(gè)背景中,多倍化都導(dǎo)致蓮座葉片面積更大,同時(shí)qrt1突變都抑制了葉片面積(圖4-E)。

    2.4 生殖生長相關(guān)表型的測定與分析

    首先對花藥進(jìn)行亞歷山大紅染色(圖5-A),所有的花粉都被染上了紅色,說明多倍化或者qrt1突變都不會影響花粉的活性。其次,我們測量了花粉(圖5-B)以及花藥中隔(圖5-C)的大小,發(fā)現(xiàn)多倍化都使其體積增大。至于果莢,多倍化導(dǎo)致每果莢種子數(shù)顯著降低(二倍體Col平均每果莢50.49粒,四倍體Col平均每果莢30.18粒;二倍體Ler平均每果莢40.99粒,四倍體Ler平均每果莢18.84粒)。

    本研究中新制四倍體C313與L311相比四倍體參照,每果莢種子數(shù)又進(jìn)一步顯著性的降低(圖5-D),3151平均每果莢32.37粒,C313平均每果莢27.98粒,3900平均每果莢20.28粒,L311平均每果莢17.40粒)。多倍化對果莢長度的影響具有背景依賴性(圖5-E),在Col中沒有影響,而在Ler中使果莢長度顯著降低(p=2.29e-68)。

    多倍化對每株果莢個(gè)數(shù)的影響同樣具有背景依賴性(圖5-F),但并不是依賴其是Col還是Ler,而是依賴于qrt1突變與否。在二倍體中,qrt1突變使果莢數(shù)顯著降低。在此基礎(chǔ)上,多倍化使野生型果莢數(shù)降低,使qrt1突變體果莢數(shù)上升。

    圖4 莖及葉的相關(guān)表型

    圖5 花以及果莢相關(guān)表型

    在對種子影響上,四倍化使種子顯著增大(圖6-A)。大小,即種子的長軸長與短軸長,形狀,即種子的離心率。四倍化導(dǎo)致種子的長軸與短軸同時(shí)增大,并最終保持種子的離心率,即形狀基本不變(圖6-B-D)。當(dāng)然Col與Ler,不同背景之間,種子的形狀就有差異,Col種子離心率更大,種子更扁。同時(shí),加倍之前,種子長軸基本一致,而加倍之后,短軸基本一致(圖6-C-D)。在種子的發(fā)芽率方面,8個(gè)背景種子的發(fā)芽率都接近100%(圖6-F),可見雖然多倍化導(dǎo)致每果莢種子數(shù)大幅降低,但結(jié)出的種子都仍然保持著很好的發(fā)芽率。

    圖6 種子相關(guān)表型

    3 討論

    四分子分析是研究遺傳重組的一項(xiàng)強(qiáng)有力的手段,但一直以來,由于高等真核生物中沒有適合應(yīng)用四分子分析的物理結(jié)構(gòu),導(dǎo)致這種實(shí)驗(yàn)手段無法被應(yīng)用于真核生物減數(shù)分裂的研究。但隨著QUARTET基因被發(fā)現(xiàn),在擬南芥中應(yīng)用四分子分析成為了可能。陸平利教授[21]應(yīng)用四分子分析成功分析了二倍體Col qrt與Ler qrt雜交后代的遺傳重組。

    在本研究中,首先從帶有QUARTET1突變的二倍體Columbia與Landsberg erecta生態(tài)型擬南芥出發(fā),利用秋水仙素誘導(dǎo)體細(xì)胞突變,并從嵌合體植株的后代中,利用流式細(xì)胞儀與熒光原位雜交技術(shù),通過對兩個(gè)傳代群體之間的縱向重復(fù)以及群體內(nèi)部的橫向重復(fù),篩選出成功加倍的帶有qrt1突變的四倍體Columbia與Landsberg erecta生態(tài)型擬南芥C313與L311。為后續(xù)構(gòu)建Col與Ler的雜交分離四倍體群體,并應(yīng)用四分子分析研究多倍體遺傳重組準(zhǔn)備了材料。其次,對篩選出的Col與Ler同源四倍體的根、莖、葉、花、果莢、種子等表型進(jìn)行了測定并與相對應(yīng)的二倍體、四倍體Col、Ler參照進(jìn)行了比對。在前人對QUARTET1表達(dá)定位研究的基礎(chǔ)上[22],通過垂直培養(yǎng)幼苗,統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)目,計(jì)算葉片面積,進(jìn)一步確認(rèn)了qrt1突變抑制了側(cè)根生長以及葉的初生生長。本研究在Columbia與Landsberg erecta兩個(gè)生態(tài)型中。既觀察到了被廣泛闡述的四倍化對營養(yǎng)生長、生殖生長的促進(jìn)作用,如蓮座葉片、花粉、花藥、種子在四倍化的影響下明顯增大;也發(fā)現(xiàn)了四倍化對某些器官的抑制效應(yīng),如側(cè)根數(shù)量、基部側(cè)枝數(shù)量、抽薹日期受到了四倍化的抑制;另外,還發(fā)現(xiàn)有些表型并未受到四倍化的影響,如主根長度、種子形狀。上述這些表型在兩個(gè)生態(tài)型背景中受到四倍化影響是相似的,同為促進(jìn)或同為抑制或都不受影響,但還有一些表型,如主莖分枝數(shù)量、最終株高、果莢長度,在兩個(gè)背景中受到四倍化的影響是不同的,顯示出四倍化對植株的作用會受到整體基因組背景的影響。在育性方面,發(fā)現(xiàn)多倍化導(dǎo)致每果莢種子數(shù)變少。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了本研究中所誘導(dǎo)得來的新制四倍體C313與L311相對于四倍體對照,每果莢中種子更少,體現(xiàn)了新制四倍體的特征。盡管種子數(shù)降低了,但不管是二倍體還是四倍體對照還是本研究中的新制四倍體,都表現(xiàn)出乎了接近100%的發(fā)芽率。

    本研究構(gòu)建的帶有qrt1突變的四倍體Col與Ler擬南芥為在四倍體中應(yīng)用四分子分析準(zhǔn)備了材料;結(jié)合本研究中測定的表型,提供了研究多倍體轉(zhuǎn)錄組的實(shí)驗(yàn)對象;還發(fā)現(xiàn)了新制四倍體與相對穩(wěn)定四倍體之間的表型差異,提供了研究新制四倍體中染色體組如何變化并趨于穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)對象。

    4 結(jié)論

    利用秋水仙素處理帶有qrt1突變的Col與Ler生態(tài)型擬南芥,通過流式細(xì)胞技術(shù)與熒光原位雜交計(jì)數(shù)篩選出成功加倍的、帶有qrt1突變的四倍體Col與Ler生態(tài)型擬南芥,并觀察測量了8個(gè)遺傳背景擬南芥的多個(gè)營養(yǎng)與生殖表型,發(fā)現(xiàn)了qrt1突變以及倍性對擬南芥不同表型的差異化影響。

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