運(yùn)動(dòng)通過Akt/GSK-3β信號(hào)通路改善大鼠糖尿病心肌病

李月紅

（巢湖學(xué)院，安徽 巢湖 238000）

1 前言

糖尿病心肌病是以在沒有冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的情況下，心功能障礙導(dǎo)致心衰為特征。在過去的幾十年中，大量的研究利用糖尿病動(dòng)物模型和糖尿病患者的臨床數(shù)據(jù)來研究糖尿病心肌病的潛在病理機(jī)制。證據(jù)表明細(xì)胞外基質(zhì)改變和心肌纖維化增加[1-3]、活性氧的過度產(chǎn)生[4]、心肌炎癥[5-7]、以促炎癥細(xì)胞因子水平的增加為特征可能在糖尿病心肌病的發(fā)生與發(fā)展中起作用。

體重降低、脂肪和總熱量攝取限制和規(guī)律的身體活動(dòng)能積極調(diào)解代謝異常，通過增加胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和胰島素受體后信號(hào)改善組織和全身性胰島素抵抗[8－9]。許多臨床研究表明，身體活動(dòng)與糖尿病患者的心血管疾病和全因死亡率顯著降低有關(guān)[10]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練有助于降低人類糖尿病患者和糖尿病動(dòng)物模型的心肌病發(fā)病率[11－12]。在缺乏對照臨床試驗(yàn)的情況下，很難通過研究資料預(yù)測身體活動(dòng)的益處。但是，規(guī)律的運(yùn)動(dòng)對更好地控制糖尿病和糖尿病預(yù)后有積極效應(yīng)。

目前，關(guān)于糖尿病心肌病的潛在機(jī)制還不清楚。假設(shè)DCM可能被運(yùn)動(dòng)逆轉(zhuǎn)。因此，研究的目的是探討運(yùn)動(dòng)對DCM發(fā)展中的作用和關(guān)于Akt/糖原合成激酶-3β信號(hào)通路的相對機(jī)制。

2 材料與方法

2.1 動(dòng)物

48只8周齡SD大鼠（體重：250—300 g），購于濟(jì)南市金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。大鼠室內(nèi)飼養(yǎng)，12小時(shí)光照循環(huán)，自由進(jìn)食18%高脂飲食和水。大鼠隨機(jī)分為4組：坐式對照組（SC）、坐式糖尿病組（SD）和運(yùn)動(dòng)糖尿病組（ED）。每周測量體重和非空腹血糖。12周后，腹腔注射烏拉坦（1 g/kg－1）麻醉后處死。心臟取血樣，分離血清用于生化測量。無菌狀態(tài)下分離心臟，并用冰冷焦炭酸二乙酯處理的蒸餾水灌注。

2.2 建立糖尿病心肌病模型

32只SD大鼠，腹膜內(nèi)注射50 mg/kg鏈脲霉素（STZ，溶于0.1 M檸檬酸緩沖液，pH4.5）。其余16只大鼠注射等量檸檬酸緩沖液，作為對照組。注射STZ3天后，用血糖儀測量血糖水平。大鼠血糖≧200 mg/dl為建模成功。

2.3 運(yùn)動(dòng)方案

在運(yùn)動(dòng)方案執(zhí)行前，連續(xù)2天讓大鼠熟悉運(yùn)動(dòng)器械。熟悉期間，大鼠在跑臺(tái)上進(jìn)行2個(gè)15 min遞增速度達(dá)到30 m/min跑。運(yùn)動(dòng)計(jì)劃包括每天1小時(shí)跑臺(tái)跑，速度為27 m/min，坡度為60，每周5天，共12周。根據(jù)先前的研究選擇運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，選擇的強(qiáng)度相當(dāng)于75—85%VO2max[13－14]。

2.4 體重、LVW和LVWI測量

大鼠稱重后，烏拉坦麻醉，迅速開胸摘取心臟。0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗心臟，測量LVW，用公式LVW/體重計(jì)算 LVWI。

2.5 HbA1c、CK-MB 和 BNP測量

用RA-50半自動(dòng)分析儀測量大鼠CK-MB和BNP水平，用Nycocard Reader II糖化血紅蛋白儀分析HbA1c。

2.6 心肌病理和CVF觀察

心組織石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色。心臟膠原用麗春紅S染色，測定CVF。簡要地說，隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域，通過膠原面積/總面積計(jì)算CVF，取平均值。選擇心室壁4條小動(dòng)脈，測量截面積。

2.7 血漿TGF-β1和CTGF測量

用夾心ELISA試劑盒測量血漿TGF-β1和CTGF水平。根據(jù)使用說明書，使用適當(dāng)控制和標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)表達(dá)為pg/ml血漿。

2.8 定量聚合酶連反應(yīng)（PCR）分析TGF-β1和CTGF mRNA表達(dá)

用TRIzol試劑提取總RNA，RNeasy試劑盒純化。總量20 μliScript cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄500 ng總RNA?？傊?，在含特異引物和iQ SYBR Green Supermix20 μl反應(yīng)液中PCR擴(kuò)增1 μl cDNA。PCR進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)，95°C 15 s，94°C 5 s，58°C 15 s和 72°C 15 s。引物序列見表1。依據(jù)比較 Ct值法和抗36B4 riboprotein mRNA數(shù)據(jù)標(biāo)化及未處理對照組平均ΔCt值校標(biāo)測定相對mRNA表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表達(dá)為對照組百分比，對照組設(shè)置為1。

表1 TGF-β1、β-actin和 CTGF引物序列

2.9 蛋白印跡分析

心臟勻漿中提取蛋白質(zhì)，等分（50 μg）進(jìn)行SDS-PAGE（7.5%gel），轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒提供的阻斷液在室溫下阻斷膜2小時(shí)。接著4°C下，膜與第一抗體孵化。等量蛋白樣本用于蛋白印跡分析，使用的大鼠抗體為 TGF-β1、CTGF、phospho-Akt、Akt、phospho-GSK-3β、GSK-3β和β-actin。膜在洗滌液中洗滌30 min，然后與辣根過氧化物酶結(jié)合的大鼠第二IgG抗體孵育。膜在洗滌液中洗滌30 min，用ECL試劑盒測定免疫反應(yīng)帶。

3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。單因素方差分析用于多組間平均值比較。設(shè)P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)顯著性。

4 結(jié)果

4.1 運(yùn)動(dòng)對糖尿病大鼠LVWI的影響

與SC組相比，SD組和ED組大鼠LVWI顯著增高（P＜0.05）。與SD組相比，ED組大鼠LVWI顯著降低（P＜0.05）（表2），說明運(yùn)動(dòng)對糖尿病大鼠LVWI具有逆轉(zhuǎn)作用。

表2 運(yùn)動(dòng)后各組 LVWI、HbA1c、CK－MB、BNP和 CVF值

4.2 運(yùn)動(dòng)對HbA1c、CK-MB和BNP水平的影響

與SC組相比，SD和ED組大鼠HbA1c、CK-MB和BNP水平顯著增高（P＜0.05）。與SD組相比，ED組大鼠HbA1c、CK-MB和BNP水平顯著降低 （P＜0.05）（表2），結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)具有逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠HbA1c、CK-MB和BNP水平的作用。

4.3 運(yùn)動(dòng)對心肌CVF的影響

SC組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，條紋清晰，無肌絲斷裂，細(xì)胞間歇均勻。SD組大鼠心肌出現(xiàn)肌原纖維排列紊亂，心肌纖維化，散在肌纖維變性，胞漿出現(xiàn)顆粒，肌纖維條紋消失，間質(zhì)水腫、增生及淋巴細(xì)胞浸潤。與SD組大鼠相比，ED組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)律。與SC組相比，SD組和ED組大鼠CVF顯著增加（P＜0.05）。但與SD組相比，ED組大鼠CVF顯著降低，運(yùn)動(dòng)逆轉(zhuǎn)糖尿病導(dǎo)致的心肌損傷（圖1）。

圖1 運(yùn)動(dòng)改善糖尿病大鼠心肌纖維化（HE染色）

4.4 運(yùn)動(dòng)糖尿病大鼠血漿TGF-β1和CTGF水平的影響

高血糖通過氧化應(yīng)激激活多種細(xì)胞因子，可能促進(jìn)DCM的發(fā)展。與SC組相比，SD組大鼠血漿TGF-β1、CTGF水平顯著增加（P＜0.01）。與 SD 組相比，運(yùn)動(dòng)顯著降低糖尿病大鼠血漿 TGF-β1、CTGF水平（P＜0.01）（圖 2）。

圖2 運(yùn)動(dòng)對糖尿病大鼠血漿TGF-β1、CTGF水平的影響。*P＜0.05，**P＜0.01與SC組比較；#P＜0.01與SD組相比。

4.5 運(yùn)動(dòng)對糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF表達(dá)的影響

心肌TGF-β1和CTGF與心肌纖維化有關(guān)，因而，對心肌組織TGF-β1和CTGF的表達(dá)進(jìn)行分析。定量PCR分析表明，與SC組相比，SD組和ED組TGF-β1和CTG mRNA表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01）。與SD組相比，ED組TGF-β1和CTG mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）（圖3）。

圖3 運(yùn)動(dòng)對糖尿病大鼠心組織TGF-β1和CTGF表達(dá)的影響，*P＜0.05，**P＜0.01與SC組比較；#P＜0.01與SD組比較。

4.6 運(yùn)動(dòng)對Akt/GSF-3β信號(hào)通路的影響

蛋白印跡分析顯示，糖尿病大鼠心肌Akt磷酸化顯著受抑制。GSK-3β明顯被激活。運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心肌p-Akt和 p-GSK-3β 顯著增加（P＜0.01）。

圖4 蛋白印跡分析運(yùn)動(dòng)對糖尿病大鼠心肌組織p-Akt和未活化的p-GSK-3β的影響，*P＜0.05，**P＜0.01與SC組比較；#P＜0.01與SD組比較。

5 討論

中等和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)被推薦為預(yù)防和治療糖尿病的一種有效手段[15]。研究中，評價(jià)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對2型糖尿病大鼠心臟功能和與炎癥相關(guān)蛋白的影響。

研究表明，運(yùn)動(dòng)具有逆轉(zhuǎn)糖尿病心肌病效應(yīng)。SD組大鼠表現(xiàn)心肌膠原蛋白過度蓄積和心肌肥大。SD組大鼠心肌中BNP和CK-MB增加，導(dǎo)致LVWI和CVFs增高。TGF-β1和CTGF表達(dá)增高，加上滅火的Akt/GSK-3β信號(hào)，最終導(dǎo)致心肌纖維化。運(yùn)動(dòng)可以逆轉(zhuǎn)糖尿病心肌病中這些特征性變化，這些有益效應(yīng)與CRFR-2有關(guān)。運(yùn)動(dòng)改善糖尿病大鼠心臟功能可能通過激活心肌Akt/GSK-3β信號(hào)通路抑制TGF-β1和CTGF過度表達(dá)。

高血糖導(dǎo)致強(qiáng)效促纖維化因子TGF-β1表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致心肌纖維化。TGF-β1是一種重要的致纖維化因子，其促進(jìn)膠原蛋白I和III的合成和分泌，誘導(dǎo)心肌纖維化[16]。在細(xì)胞外基質(zhì)蓄積的發(fā)展過程中，CTGF可能是TGF-β1的一個(gè)下游調(diào)節(jié)因子[17]。研究顯示，與SC組相比，SD組大鼠LVWI、BNP、CKMB、CVF水平和TGF-β1和CTGF mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高，SD組大鼠TGF-β1和CTGF表達(dá)水平與心肌重塑密切相關(guān)。

Akt通過抑制參與凋亡信號(hào)級聯(lián)的多個(gè)靶點(diǎn)來促進(jìn)細(xì)胞存活。GSK-3β是Akt的一個(gè)重要底物。GSK-3β具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和信號(hào)通路的功能。p-Akt在發(fā)病后4小時(shí)顯著增加，72小時(shí)后下降。此外，p-Akt促進(jìn)GSK-3β磷酸化，4小時(shí)時(shí)輕微增加，72小時(shí)時(shí)達(dá)高峰。心肌損傷后2小時(shí)，活化的GSK-3β高表達(dá)。這種表達(dá)先于經(jīng)典的Akt/GSK-3β信號(hào)通路。研究記過表明運(yùn)動(dòng)抑制Akt，Akt/GSK-β信號(hào)通路與運(yùn)動(dòng)改善DCM的效應(yīng)有關(guān)。

總之，研究表明運(yùn)動(dòng)顯著抑制糖尿病大鼠心臟功能障礙、心肌纖維化和炎癥。運(yùn)動(dòng)具有逆轉(zhuǎn)心室重塑，抑制心肌肥大，降低膠原蛋白含量的作用，保護(hù)心臟功能。運(yùn)動(dòng)通過影響CRFR-2抑制TGF-β1和CTGF表達(dá)。

6 結(jié)論

研究表明，運(yùn)動(dòng)顯著改善心臟功能。運(yùn)動(dòng)抑制糖尿病大鼠心肌纖維化和炎癥，運(yùn)動(dòng)的這些效應(yīng)與抑制TGF-β1和CTGF表達(dá)以及Akt/GSK-β信號(hào)通路有關(guān)。