新疆南部圖蘭扇頭蜱及卵攜帶R. raoultii的分子檢測

劉永宏，李貝貝，李凱瑞，何波，張敬博，蒲小峰，陳梅娟，潘姣姣，李飛，張路瑤，趙麗

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新疆南部圖蘭扇頭蜱及卵攜帶的分子檢測

劉永宏1，李貝貝1，李凱瑞1，何波1，張敬博1，蒲小峰1，陳梅娟1，潘姣姣1，李飛2，張路瑤3，趙麗1

（1塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；2新疆阿克蘇地區(qū)動物疫病控制診斷中心， 新疆阿克蘇 843000；3巴里坤哈薩克自治縣畜牧獸醫(yī)工作站，新疆哈密 839200）

【目的】世界上蜱類3科18屬899種，中國有2科10屬117種，新疆至少有2科10屬45種，占全國蜱種類的1/3之多，分布也極其廣泛。蜱直接危害和傳播多種病原，且一些病原可經(jīng)卵垂直傳播，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。圖蘭扇頭蜱是新疆南部荒漠及半荒漠地區(qū)常見種和優(yōu)勢種。確定新疆南部圖蘭扇頭蜱及其卵是否攜帶立克次體，對該蜱及其傳播立克次體病的防控意義重大?！痉椒ā繉π陆a(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在新疆南部阿拉爾市某羊場收集的飽血雌性扇頭蜱，置于一定濕度和一定溫度的環(huán)境中產(chǎn)卵，隨機(jī)取5個獨(dú)立的卵樣品及其對應(yīng)的5只雌蜱為研究對象。通過對雌蜱及其卵分別處理后提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增蜱12S rRNA基因和立克次體16S rRNA基因，并對擴(kuò)增產(chǎn)物測序，利用BLAST在線平臺和多個分子生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析?！窘Y(jié)果】5只雌蜱12S rRNA基因PCR擴(kuò)增全部陽性，測序獲得的4段蜱12S rRNA基因序列完全一致；Blast分析與GenBank數(shù)據(jù)庫中圖蘭扇頭蜱12S rRNA基因序列相似性高達(dá)99%以上，且高相似性前五基因序列均為圖蘭扇頭蜱，其中包括來自新疆綿羊的圖蘭扇頭蜱；本研究蜱12S rRNA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號為MG744514，與來自于GenBank數(shù)據(jù)庫圖蘭扇頭蜱、血紅扇頭蜱、微小牛蜱、邊緣革蜱、草原革蜱、長角血蜱、小亞璃眼蜱、亞洲璃眼蜱、殘緣璃眼蜱、全溝硬蜱及外圍群塵螨的22個12S rRNA基因序列的進(jìn)化樹顯示，研究所獲得的蜱12S rRNA基因序列與圖蘭扇頭蜱進(jìn)化關(guān)系最近，聚在同一個小分支；確定了該扇頭蜱為圖蘭扇頭蜱。5只產(chǎn)卵后的雌蜱和相應(yīng)蜱所產(chǎn)的全部卵立克次體16S rRNA基因PCR擴(kuò)增，有1只蜱和其產(chǎn)的卵樣品陽性，蜱攜帶率為20%；雌蜱及其卵立克次體16S rRNA基因測序結(jié)果完全一致；Blast分析與GenBank數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列相似性高達(dá)99%以上，且高相似性前五基因序列為4個和1個sp.，其中包括來自新疆2011年的亞洲璃眼蜱和草原革蜱的立克次體；立克次體16S rRNA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號為MG744513，與來自于GenBank數(shù)據(jù)庫的37個24種立克次體16S rRNA基因序列的進(jìn)化樹顯示，研究獲得的立克次體16S rRNA基因序列與進(jìn)化關(guān)系最近，聚在同一個小分支，與其他15種立克次體同屬于斑點(diǎn)熱群立克次體；確定了本研究圖蘭扇頭蜱及其卵均攜帶斑點(diǎn)熱群立克次體?！窘Y(jié)論】首次發(fā)現(xiàn)圖蘭扇頭蜱及其卵攜帶。

勞氏立克次體；卵；圖蘭扇頭蜱；新疆

0 引言

【研究意義】世界上蜱類3科18屬899種[1]，中國有2科10屬117種[2]。新疆至少有2科10屬45種[3]，占全國蜱種類的1/3之多，分布也極其廣泛。蜱直接叮咬造成動物出現(xiàn)炎癥、貧血、癱瘓、中毒、過敏以及通過皮膚損傷處繼發(fā)感染和發(fā)生蠅蛆病等，且蜱攜帶和傳播多種病原體，不僅給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，還是僅次于蚊的人類疾病第二大傳播媒介，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全[4]。調(diào)查蜱種類及其攜帶病原情況，對當(dāng)?shù)仳缂膀鐐鞑〉姆揽匾饬x重大。【前人研究進(jìn)展】圖蘭扇頭蜱（）屬于硬蜱科（）扇頭蜱亞科（）扇頭蜱屬（），三宿主蜱，主要寄生于駱駝、牛、馬、綿羊、山羊等家畜和野生動物[5]。圖蘭扇頭蜱在中國分布于新疆、陜西、江蘇、云南和廣西，是新疆南部荒漠及半荒漠地區(qū)常見種和優(yōu)勢種，新疆周邊國家分布也極為廣泛[5-6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】已報道，經(jīng)軟蜱或硬蜱可垂直傳播的病原有非洲豬瘟病毒[7]、新疆出血熱病毒[8]、克里米亞-剛果出血熱病毒[9]、伯氏疏螺旋體[10]、巴貝斯蟲[11]、斑點(diǎn)熱群立克次體[12]、西伯利亞立克次體、貝氏立克次體[13]、似柯克斯氏體屬共生體、似立克次體屬共生體[14]、[15]、和[16]，等等。綜上所述，一種病原是否經(jīng)蜱的卵傳播的研究是非常必要的，研究結(jié)果可對分析該病的蔓延和流行風(fēng)險評估提供基礎(chǔ)信息和科學(xué)參考?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過對新疆南部扇頭蜱屬蜱結(jié)合分子生物學(xué)進(jìn)行蜱種類鑒定，然后對飽血雌蜱和其產(chǎn)的卵通過立克次體屬基因擴(kuò)增進(jìn)行立克次體及其種類的鑒定與分析，以期為蜱及蜱傳病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年4—7月在塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

1.1.1 扇頭蜱及其卵 飽血雌蜱（圖1），于2017年5月采集于新疆南部阿拉爾市某團(tuán)場一個羊場，約50只，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定均為扇頭蜱屬蜱（圖2）；飽血雌蜱置于一定濕度和一定溫度的環(huán)境中產(chǎn)卵，隨機(jī)取5個具有獨(dú)立空間的卵樣品（1個卵樣品為1只雌蜱所產(chǎn)全部卵，圖3箭頭所示）及其對應(yīng)的5只產(chǎn)卵雌蜱為后續(xù)研究對象。

1.1.2 引物和參考基因序列 鑒定蜱種類的基因擴(kuò)增引物為12S-F：5′-AAA CTA GGA TTA GAT ACC CT-3′，12S-R: 5′-AAT GAG AGC GAC GGG CGA TGT-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為320 bp[17]；鑒定立克次體種類16S rRNA基因擴(kuò)增引物為16S-F：5′-ATC AGT ACG GAA TAA CTT TTA-3′，16S-R：5′-TGC CTC TTG CGT TAG CTC AC-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 332 bp[18]，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

基因分析參考序列均來源于NCBI數(shù)據(jù)庫，序列名稱和GenBank登錄號見圖5和圖6。

1.1.3 主要試劑及儀器 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0 (Code No. 9765)、Premix TaqTM（TakaRa TaqTMVersion 2.0）(Code No. R004A)和DL2000 DNA Marker（Code No. 3427A），購自寶生物工程（大連）有限公司。PCR儀（TC-5000, Bibby scientific Ltd），小型高速冷凍離心機(jī)（R134a, Hermetically sealed refrigeration system），電泳儀（DYY-12，北京市六一儀器廠），紫外分析儀（JY02S，北京君意東方電泳儀設(shè)備有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 雌蜱和卵分別用蒸餾水洗脫3次后，無菌濾紙吸干，置于2mL無菌管中，按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0（Code No. 9765）試劑盒說明書操作，提取基因組DNA，最后用50 μL無菌水洗脫收集DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 按照Premix TaqTM（TakaRa TaqTMVersion 2.0）（Code No. R004A）試劑盒說明書對蜱12S rRNA基因和立克次體16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR體系均為50 μL，PCR反應(yīng)條件分別為：94℃ 5 min—5個循環(huán)（94℃ 15 s，51℃ 30 s，68℃ 30 s）—25個循環(huán)（94℃ 15 s，53℃ 30 s，70℃ 30 s）—70℃ 5 min和95℃ 5 min—30個循環(huán)（95℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 90 s）—72℃ 5 min。

1.2.3 序列分析 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳鑒定后，30μL陽性擴(kuò)增產(chǎn)物與上下游引物一同送生工生物工程（上海）有限公司測序。測序結(jié)果利用BLAST在線平臺（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）、Primer Premier 5.0、DNAMAN、DNAStar和MEGA5.0軟件，進(jìn)行種系發(fā)育分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

通過蜱12S rRNA基因擴(kuò)增引物對產(chǎn)卵后的雌蜱基因組DNA進(jìn)行PCR，結(jié)果5只雌蜱樣品擴(kuò)增全部陽性，產(chǎn)物與預(yù)期大小一致；通過立克次體16S rRNA基因擴(kuò)增引物對產(chǎn)卵后的雌蜱和其所產(chǎn)的卵基因組DNA分別進(jìn)行PCR，結(jié)果1只蜱和其產(chǎn)的卵樣品（20%，1/5）擴(kuò)增均為陽性，產(chǎn)物與預(yù)期大小一致（圖4）。

2.2 Blast比對分析

蜱12S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物全部送測序，獲得的4段蜱12S rRNA基因序列完全一致，通過Blast在線分析，與數(shù)據(jù)庫中圖蘭扇頭蜱12S rRNA基因序列相似性最高，達(dá)99%以上，且高相似性前五基因序列均為圖蘭扇頭蜱（表1），其中包括來自新疆綿羊的圖蘭扇頭蜱，本研究蜱12S rRNA基因測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得的登錄號為MG744514。產(chǎn)卵后的雌蜱和卵立克次體16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物送測序，來自雌蜱和卵的該基因測序結(jié)果完全一致，通過Blast比對分析，與數(shù)據(jù)庫中基因序列相似性最高，達(dá)99%以上，且高相似性前五基因序列為4個和1個（表1），其中包括來自新疆2011年的亞洲璃眼蜱和草原革蜱的立克次體，本研究立克次體16S rRNA基因測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得的登錄號為MG744513。

圖1 寄生于新疆阿拉爾市綿羊耳部的蜱

圖2 扇頭蜱屬蜱

圖3 雌蜱產(chǎn)的卵

2.3 序列分析

來自于GenBank數(shù)據(jù)庫圖蘭扇頭蜱、血紅扇頭蜱、微小牛蜱、邊緣革蜱、草原革蜱、長角血蜱、小亞璃眼蜱、亞洲璃眼蜱、殘緣璃眼蜱、全溝硬蜱及外圍群塵螨的22個12S rRNA基因序列，與本研究序列一同進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析。進(jìn)化樹顯示，本研究獲得的蜱12S rRNA基因序列與圖蘭扇頭蜱進(jìn)化關(guān)系最近，聚在同一個小分支（圖5）。

來自于GenBank數(shù)據(jù)庫的37個24種立克次體16S rRNA基因序列，與本研究序列一同進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析。進(jìn)化樹顯示，本研究獲得的立克次體16S rRNA基因序列與進(jìn)化關(guān)系最近，聚在同一個小分支，與其他15種立克次體同屬于斑點(diǎn)熱群立克次體（圖6）。

表1 蜱12S rRNA基因和立克次體16S rRNA基因Blast比對分析

M：Marker；1—5：蜱12S；6和9：陰性對照；7：蜱立克次體16S；8：卵立克次體16S

▲標(biāo)注序列為本研究序列 The black trilateral tagging sequence is the sequence of this research

●標(biāo)注序列為本研究序列 The black circles tagging sequence is the sequence of this research

3 討論

對扇頭蜱屬蜱進(jìn)行12S rRNA基因PCR擴(kuò)增及測序，通過Blast比對分析，本研究獲得GenBank登錄號為MG744514的序列與數(shù)據(jù)庫中多個圖蘭扇頭蜱12S rRNA基因序列相似性達(dá)到99%以上。且與多種蜱及外圍群塵螨的22個12S rRNA基因序列進(jìn)化樹顯示，本研究12S rRNA基因序列與圖蘭扇頭蜱進(jìn)化關(guān)系最近，聚在同一個小分支。綜合以上所述，本研究蜱樣品為圖蘭扇頭蜱。文獻(xiàn)[5-6]也報道，圖蘭扇頭蜱為新疆南部荒漠及半荒漠地區(qū)常見種和優(yōu)勢種，也有報道新疆伊寧縣圖蘭扇頭蜱具有生物多樣性[19]。新疆南部圖蘭扇頭蜱是否具有多樣性及其他特征，需要進(jìn)一步利用大量樣本結(jié)合多個基因?qū)ζ溲芯糠治?。另外一方面，本研究對雌性圖蘭扇頭蜱及其產(chǎn)的卵進(jìn)行立克次體16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及測序，其中一組蜱和卵樣品PCR擴(kuò)增均為陽性。測序結(jié)果通過Blast比對分析，本研究獲得GenBank登錄號為MG744513的序列與數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列相似性達(dá)到99%以上。且與24種立克次體16S rRNA基因序列進(jìn)化樹顯示，本研究獲得的立克次體16S rRNA基因序列與進(jìn)化關(guān)系最近，聚在同一個小分支。參照文獻(xiàn)[18，20]分析本研究獲得的與其他12種立克次體同屬于斑點(diǎn)熱群立克次體。

1999年，發(fā)現(xiàn)于短小扇頭蜱和草原革蜱[21]。目前，歐洲、北美洲、南美洲和亞洲發(fā)現(xiàn)了這種立克次體[22]。中國，早在2008年吉林森林革蜱發(fā)現(xiàn)了[23]，近年來西藏[24]、新疆[25-27]、黑龍江[28-29]等地區(qū)先后報道發(fā)現(xiàn)了。本研究補(bǔ)充了新疆南部發(fā)現(xiàn)，也證實(shí)了新疆確實(shí)存在，文獻(xiàn)也報道為新疆的廣布種[12]。2016年之前的報道，僅報道于蜱，至少有13種蜱（僅包括1種扇頭蜱），多見于革蜱[22]，尤其西藏地區(qū)革蜱攜帶率高達(dá)84.6%[24]。本研究首次在圖蘭扇頭蜱中發(fā)現(xiàn)了，且在雌蜱產(chǎn)的卵中也發(fā)現(xiàn)了。圖蘭扇頭蜱對是偶然感染還是可以長期穩(wěn)定傳播、卵是否可以穩(wěn)定多代傳遞該病原、新疆南部地域地貌和特殊氣候等是否對圖蘭扇頭蜱感染有影響等等，諸多問題均需要進(jìn)一步研究，分析大量樣品證實(shí)。但是，結(jié)合2016年石河子大學(xué)報道[26]新疆羊蜱蠅和新疆醫(yī)科大學(xué)報道新疆長尾黃鼠檢測到[27]，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分析的宿主分布和其他特征還存在諸多未知。另外，本研究采集的蜱樣通過形態(tài)學(xué)鑒定，均為扇頭蜱屬蜱，且隨機(jī)取的5只蜱樣分子生物學(xué)鑒定獲得的12S rRNA基因序列一致，鑒定為圖蘭扇頭蜱，即本研究綿羊宿主體外寄生單一種類蜱。結(jié)合本研究圖蘭扇頭蜱的感染率為20%，且卵中檢測到了，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分析圖蘭扇頭蜱對的感染和傳播可能有其復(fù)雜機(jī)制和重要意義。此外，近年來包括中國的多個國家報道對人致病，引起蜱傳淋巴結(jié)炎和蜱傳壞死紅斑淋巴結(jié)病，受到了衛(wèi)生部門及相關(guān)研究機(jī)構(gòu)的關(guān)注[29-30]。關(guān)于感染宿主細(xì)胞的機(jī)制和在動物群體的流行病學(xué)研究等，需要相關(guān)學(xué)者進(jìn)一步研究。新疆南部地區(qū)需要長期對蜱、動物及人是否攜帶等蜱傳病原進(jìn)行監(jiān)測，及時了解蜱傳病原的動態(tài)，以便有效防控感染等蜱傳病。

4 結(jié)論

在中國新疆南部首次發(fā)現(xiàn)圖蘭扇頭蜱，其雌蜱及其卵攜帶斑點(diǎn)熱群立克次體。這為深入研究經(jīng)蜱傳播奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Molecular Detection ofand Its Eggs Carryingin Southern Xinjiang

LIU YongHong1, LI BeiBei1, LI KaiRui1, HE Bo1, ZHANG JingBo1, PU XiaoFeng1, CHEN MeiJuan1, PAN JiaoJiao1, LI Fei2, ZHANG LuYao3, ZHAO Li1

(1College of Animal Science, Tarim University/Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology of Xinjiang Production & Construction Corps, Alar 843300, Xinjiang;2Animal Loimia Controlling and Diagnostic Center of Aksu Region, Aksu 843000, Xinjiang;3Animal husbandry and veterinary workstations of Barkol kazak autonomous county, Kumul 839200, Xinjiang)

【Objective】 There are 899 species of ticks in the world, belonging to 18 genera and 3 families, and there are 117 species in China, belonging to 2 families, 10 genera. There are at least 45 species in Xinjiang, accounting for more than 1/3 of the national ticks, and its distribution is extremely wide. Ticks can directly harm and spread many kinds of pathogens, and some pathogens can propagate vertically through eggs, causing huge economic losses to animal husbandry, and seriously threatening public health security.is one of the common species and dominant species in the desert and semi-desert region of southern Xinjiang. It is of great significance to confirm whetherand its eggs are carrying thein the southern Xinjiang of China, so as to prevent and control ofand its transmission of.【Method】 The satiated blood femalewere collected from a sheep farm in alar, southern Xinjiang, and oviposited eggs at a certain humidity and temperature. A random sample of 5 independent eggs and the corresponding 5 femalewere as the research object. The genomic DNA were extracted from the femaleand eggs, respectively. In this study, ticks 12S rRNA gene and16S rRNA gene were amplified by conventional PCR, and the amplification products were sequenced and underwent sequence analysis by using BLAST online platform and multiple molecular biology software.【Result】 The 12S rRNA gene PCR amplification of 5 female ticks were all positive, and 4 segment of 12S rRNA gene sequence obtained by sequencing were identical. The similarity of12s rRNA gene sequence and GenBank12s rRNA gene sequences in the database were more than 99% using Blast analysis, and the top five gene sequences of the high similarity were, includingfrom Xinjiang sheep. In this study, the12S rRNA gene sequence was submitted to the GenBank database and obtained the login number of MG744514. The phylogenetic tree from GenBank database,,,,,,,,,and12S rRNA gene sequence display, the12S rRNA gene sequence obtained in this study was closest within the evolutionary relationship and clustered in the same small branch.was identified asPCR amplification of all eggs16S rRNA gene and 5 oviposit female, 1and its eggs samples were positive, and the tick carrying rate was 20%. The sequencing results of 16S rRNA in femaleand its eggs were identical. The similarity was more than 99% of the16S rRNA gene sequences in the GenBank database using Blast analysis. The top five genes of high similarity were 4and 1sp, including theof theandfrom Xinjiang in 2011. In this study, the16S rRNA gene sequence was submitted to the GenBank database and obtained the login number of MG744513. Evolutionary tree of 3716S rRNA gene sequences belonging to 24 species from the GenBank database showed, the16S rRNA gene sequence obtained in this study was closest within the evolutionary relationship and clustered in the same small branch, belonging to the speckle thermal groupwith the other 15 kinds of rickettsia.and its eggs carriedofspotted fever group. 【Conclusion】were first found inand its eggs.

; eggs;;Xinjiang

2018-01-05；

2018-03-16

國家自然科學(xué)基金（31460655）、大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（107572017009，107572017014）、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（HS201501，HS201801）

劉永宏，E-mail：lyhdky@126.com。通信作者趙麗，E-mail：zhaolidky@126.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.0017