毛竹入侵森林對固氮微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響

周 燕，劉彩霞，徐秋芳，梁辰飛，陳俊輝，秦 華，李永春

（浙江農(nóng)林大學環(huán)境與資源學院/浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點實驗室，浙江臨安 311300）

毛竹 (Phyllostachys pubescens) 是中國的鄉(xiāng)土物種[1]，栽培歷史悠久、分布面積廣，主要生長于閩、贛、浙、湘等南方省份[2]，是十分重要的經(jīng)濟樹種之一。因其在食品、工藝美術(shù)、建筑等方面均具有重要的經(jīng)濟價值，從300多年前開始，被陸續(xù)引種至日本及一些歐美國家[1]。有關(guān)毛竹入侵周邊林地的現(xiàn)象，最早在1996年報道于日本[3]。中國同樣存在著各種程度的毛竹入侵現(xiàn)象，有越來越多的闊葉林、杉木林等天然林地被毛竹林所替代。江西的大崗山[4]、井岡山自然保護區(qū)[5]，江蘇的龍背山森林公園[6]以及浙江的天目山自然保護區(qū)等都有關(guān)于毛竹入侵到周邊林地的報道。根據(jù)國內(nèi)外不同地區(qū)的調(diào)查顯示，毛竹林前沿向周邊林地蔓延的速度基本可達到每年1～2 m[3,7–8]。

毛竹以無性繁殖為主，地下竹鞭具有很強的繁殖能力，橫向蔓延至周邊長筍、成竹。母竹通過竹鞭運輸同化產(chǎn)物提供給新竹，未展葉新竹以及矮小的新竹不會因無法進行光合作用而死亡[9]，在毛竹的成竹階段，土壤—竹葉—大氣間形成了強大的水勢差，及時補充新葉充足的水分，促進毛竹快速生長[10]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，毛竹產(chǎn)生的一些化感物質(zhì)對其他植物的生長產(chǎn)生潛在的抑制作用[11]。以上這些毛竹的性質(zhì)都是引起毛竹向周邊林地不斷擴張、最后完全代替原樹種的重要因素。植物入侵會影響入侵地的原有生態(tài)系統(tǒng)，甚至導(dǎo)致本地植物滅絕，使得生態(tài)系統(tǒng)失衡[12]，這種情況也可能發(fā)生在毛竹入侵的過程中。

在中國，已有不少研究者關(guān)注毛竹入侵后對原有生態(tài)系統(tǒng)所造成的各方面影響。楊清培等[4]研究發(fā)現(xiàn)大崗山因毛竹入侵常綠闊葉林導(dǎo)致森林生態(tài)系統(tǒng)總碳儲量減少了15.37%，其中土壤碳儲量減少了17.30%；歐陽明等[5]報道毛竹入侵導(dǎo)致井岡山自然保護區(qū)次生常綠闊葉林群落組成和結(jié)構(gòu)簡化、物種多樣性下降；史紀明等[6]調(diào)查發(fā)現(xiàn)毛竹入侵限制了龍背山杉木的生長。位于浙江省杭州市臨安區(qū)西北部的天目山國家自然保護區(qū)，從1985年起就有學者研究毛竹入侵周邊林地與生物多樣性之間的矛盾問題[13]。在動物方面，楊淑貞等[14]調(diào)查發(fā)現(xiàn)保護區(qū)內(nèi)毛竹蔓延導(dǎo)致了鳥類種類和數(shù)量的減少。在植物多樣性方面，林倩倩等[15]發(fā)現(xiàn)受毛竹入侵影響，保護區(qū)的闊葉林、針葉林等林地內(nèi)，喬木層的物種豐富度、多樣性和均勻度呈現(xiàn)降低趨勢，而灌木層物種的各項多樣性指數(shù)則上升，草木層無變化。吳家森等[16]研究毛竹入侵對土壤肥力的影響，發(fā)現(xiàn)土壤的各個肥力指標在毛竹入侵過程中變化并不一致，其中堿解氮含量上升，而有效磷和速效鉀則下降。土壤中的微生物也會受到不同程度的干擾。Xu等[17]通過不同實驗手段研究土壤微生物群落，表明在毛竹入侵影響下土壤微生物的生物量和多樣性均增加，但功能多樣性并無顯著改變。潘璐等[18]研究報道，毛竹擴張不會減弱菌根侵染林木的頻率和強度。土壤中細菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性同樣不受毛竹入侵的顯著影響[19]，但真菌的數(shù)量在毛竹入侵后顯著下降[20]。

土壤固氮微生物是土壤中一類重要的功能性微生物，能夠直接將空氣中的氮還原成氨供給植物吸收利用[21]。氮是植物生長的必需營養(yǎng)元素，與毛竹的出筍、成竹過程有著密切的關(guān)系[22]，在毛竹入侵周邊林地的過程中，土壤的氮素礦化和有效性都會受到影響[23]。在沒有人為經(jīng)營的林地中，生物固氮是主要的氮素來源，因而，土壤固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性是評價森林生態(tài)功能十分重要的參數(shù)。因此，我們假設(shè)，毛竹入侵會引起林地土壤固氮微生物群落的變化。

本研究選擇天目山保護區(qū)作為試驗地，分別采集毛竹林、毛竹與原林混交林、原有林 (闊葉林或針闊混交林) 土壤，利用末端限制性片段長度多態(tài)性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)技術(shù)和熒光定量 PCR (quantitative PCR，qPCR) 方法，揭示毛竹入侵過程中土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的變化，為毛竹入侵對生態(tài)功能影響評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

天目山國家自然保護區(qū) (30°18′～30°25′N，119°23′～119°29′E)，屬中亞熱帶向北亞熱帶過渡型氣候區(qū)，海拔300～1500 m，年平均氣溫8.8～14.8℃，多年平均降水量1390～1870 mm，無霜期209～235 d，年太陽總輻射3770～4460 MJ/m2，這些氣候條件適合毛竹的生長繁衍。保護區(qū)內(nèi)的植被類型分為常綠闊葉林、常綠落葉闊葉混交林、針葉林、落葉闊葉林、竹林 (主要為毛竹林) 等[24]，土壤母質(zhì)主要為凝灰?guī)r類、花崗巖類、砂泥質(zhì)巖類、碳酸鹽巖類和紅色砂礫巖類五種風化殘坡積物類型[25]。天目山自1956年林區(qū)禁伐建立為自然保護區(qū)后，原先由人為種植的毛竹在沒有人為干擾下不斷蔓延生長，至2014年近60年間，毛竹林面積已從55.1 hm2擴大至 105.4 hm2[26]。

在保護區(qū)內(nèi)，選擇三個典型的毛竹入侵帶 (大約相距2公里)，入侵帶一為青龍山，原林地為針闊混交林，土壤母質(zhì)為泥質(zhì)灰?guī)r，林下灌木比較豐富；入侵帶二為石門洞，原林地為闊葉林，母質(zhì)為泥質(zhì)灰?guī)r，純毛竹林中灌木很少，有大量死竹，而混交林和闊葉林中有較多灌木；入侵帶三為進山門，原林地為闊葉林，母質(zhì)為石英斑巖，林下植被和樣地二類似。

1.2 土壤樣品采集與處理

在三個入侵帶中，依次沿毛竹入侵的方向分別選取三種林分：毛竹純林 (BB)、混交林 (BBBL)、闊葉林或針闊混交林 (BL)，每種林分中各劃定6個10 m × 10 m 的樣地，樣地間隔距離 40 m，各個樣地中選取5個采樣點，刮去表層枯枝落葉，采集0—20 cm的表層土壤[20]。5個采樣點的土壤充分混勻后過2 mm篩作為一個土壤樣品，共計54個土樣。新鮮土樣取一小部分經(jīng)冷凍干燥后保存用于提取微生物DNA，其余自然風干用于測定土壤基本理化性質(zhì)等。

1.3 樣品分析方法

1.3.1 土壤基本化學性質(zhì)的測定 基本的土壤化學性質(zhì)參考文獻[27]進行測定：土壤pH值測定采用1∶2.5土水質(zhì)量比，用復(fù)合電極測定；有機碳含量采用K2Cr2O7–濃H2SO4外加熱法測定；堿解氮采用堿解擴散法；有效磷采用Bray法，HCl-NH4F溶液浸提，鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用NH4Ac浸提，火焰分光光度計測定；硝態(tài)氮、銨態(tài)氮用2 mol/L KCl溶液浸提，前者用紫外分光光度法，后者用靛酚藍比色法測定。

1.3.2 土壤總 DNA 的提取 用 PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒 (Mo Bio，美國) 提取土壤總 DNA。用NanoDrop核酸蛋白測定儀 (ND-1000)(ThermoFisher，美國) 測定DNA的濃度和純度，所有樣品濃度平均值為 40～120 ng/μL。

1.3.3 土壤固氮微生物的群落分析 土壤固氮微生物的群落分析采用T-RFLP技術(shù)，PCR反應(yīng)體系如下：Premix TaqTM(TaKaRa，大連) 25 μL，采用引物nifHF (AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC)和 nifHRb (TGSGCYTTGTCYTCRCGGATBG GCAT)[28](10 μmol/L) 各 0.5 μL，BSA (Bovine Serum Albumin Solution)(TaKaRa，大連)0.5 μL，模板 DNA 1 μL，用滅菌水補充至 50 μL。其中，nifHF 的 5′端帶有FAM熒光標記。PCR反應(yīng)采用Touch-down PCR 程序，步驟如下：95℃ 5 min，94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，之后退火溫度每個循環(huán)降低1℃，直到54℃；接下來按照54℃退火溫度循環(huán)28 次，72℃ 10 min。

采用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒 (生工，上海) 純化PCR產(chǎn)物。選擇限制性內(nèi)切酶HaeⅢ[29](TaKaRa，大連)。酶切體系如下：酶 1.5 μL，Buffer 3 μL，純化產(chǎn)物 20 μL，用無菌雙蒸水補充至 30 μL。酶切過程：37℃ 12 h，65℃ 20 min。酶切完成，將產(chǎn)物送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司進行檢測分析。

1.3.4 土壤固氮微生物的豐度分析 以土壤總 DNA為模板，采用qPCR法測定固氮微生物nifH基因拷貝數(shù)。反應(yīng)體系如下：SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，采用同 T-RFLP 的引物 (50 μmol/L) 各 0.2 μL，模板 DNA 1 μL，用無菌雙蒸水補充至 20 μL。使用Bio-Rad CFX96TMThermal Cycler儀器 (Bio-Rad，美國) 進行擴增，每個樣品進行3次重復(fù)。反應(yīng)程序如下：95℃ 10 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)39次。標準曲線制作：用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit (全式金，北京) 提取含有插入 nifH 基因片段的質(zhì)粒 DNA，按梯度 (10–1～10–7) 進行稀釋，選擇其中的10–2～10–7梯度做標曲。三個入侵帶的擴增效率分別為95.9%、104.8%、101.3%，R2分別為0.999、0.993、0.998。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS18統(tǒng)計軟件進行顯著性檢驗和Pearson相關(guān)性分析，使用Duncan法進行多重比較。T-RFLP數(shù)據(jù)處理方法：計算每一個T-RF的百分比 (± 1.5 bp 的可歸為一個 T-RF)；去除小于 1% 的部分，以及低于 45 bp (雜峰、引物峰) 和高于 400 bp(引物長度) 的部分；6個重復(fù)間重現(xiàn)性不高的部分也去除；做接下來的分析[29]。使用BIO-DAP軟件計算微生物的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和均勻度指數(shù)。采用R軟件進行多響應(yīng)置換過程分析 (multiresponse permulation procedures，MRPP)，采用Canoco 4.5軟件進行微生物與土壤化學性質(zhì)之間的冗余分析 (redundancy analysis，RDA)，其中均采用999次的蒙特卡洛置換檢驗顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹入侵對土壤化學性質(zhì)的影響

如表1顯示，在毛竹入侵過程中，土壤pH和有機碳含量在三個入侵帶中變化規(guī)律一致，表現(xiàn)為毛竹純林最高，混交林次之，原林地最低，其中青龍山和石門洞入侵帶毛竹與原林之間差異顯著 (P ＜0.05)；土壤堿解氮和銨態(tài)氮含量在青龍山入侵帶均隨毛竹入侵顯著上升，毛竹與原林的差異顯著 (P ＜0.05)，而在石門洞和進山門入侵帶總體上毛竹高于原林，但差異不顯著；土壤有效磷含量在石門洞和進山門入侵帶隨毛竹入侵上升，而青龍山則入侵前后差異不大；毛竹入侵后速效鉀含量在三個入侵帶均呈下降趨勢，其中石門洞和進山門差異顯著 (P ＜0.05)；硝態(tài)氮的變化趨勢均不顯著?？傮w上，入侵帶土壤的養(yǎng)分含量在毛竹入侵后有所上升。

表1 三個入侵帶土壤化學性質(zhì)Table1 Soil chemical properties of the three invasion belts

2.2 毛竹入侵對土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

如圖1顯示，青龍山、石門洞和進山門三個入侵帶土壤中分別篩選出18、16和19個T-RFs (terminal restriction fragments)，其中 48 bp 在三個入侵帶中均占絕對優(yōu)勢，青龍山和石門洞土壤的相對百分比高達40%左右 (36%～45%)，進山門相對較低 (13%～30%)，青龍山和進山門入侵帶毛竹低于闊葉林，石門洞則相反，毛竹入侵前后土壤48 bp的變化趨勢并不一致。三個入侵帶土壤中除了共有的T-RFs 外，還擁有各自獨特的T-RFs，這些T-RFs在毛竹入侵過程中變化各異。青龍山入侵帶土壤減少2個T-RFs(267 bp在混交林土壤中消失，182 bp在毛竹純林中消失)，增加1個 T-RF (84 bp 在毛竹純林中出現(xiàn))，其他T-RFs變化不顯著；石門洞減少4個T-RFs (141 bp、182 bp 和 237 bp 在混交林中消失，125 bp 在毛竹純林中消失)，增加1個T-RF (109 bp在混交林中出現(xiàn))，其他T-RFs變化不顯著；進山門減少3個TRFs (69 bp、304 bp 和 341 bp 均在毛竹純林中消失)，增加2個 T-RFs (74 bp、122 bp 在混交林中出現(xiàn))，182 bp 顯著減少 (P＜0.05)，57 bp 顯著上升 (P＜0.05)。

將三個入侵帶的土壤固氮微生物T-RFLP數(shù)據(jù)分別按林分分組 (BB、BBBL、BL) 進行MRPP分析(表2)。青龍山入侵帶的土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)在混交林和原林地之間差異最大，其次是毛竹純林和混交林之間，但均無顯著差異；石門洞入侵帶中，毛竹純林和原林地 (P = 0.005)、混交林和原林地 (P =0.021) 之間的土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著差異；進山門入侵帶中，毛竹純林和混交林 (P = 0.002)、原林地 (P = 0.032) 之間都有顯著差異。將土壤固氮微生物T-RFLP數(shù)據(jù)按不同入侵帶分組 (青龍山、石門洞、進山門) 進行MRPP分析，結(jié)果表明，三個入侵帶的土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)兩兩之間均具有極顯著差異 (P = 0.001)。

2.3 毛竹入侵對土壤固氮微生物多樣性指數(shù)影響

根據(jù)T-RFLP數(shù)據(jù)計算得出土壤固氮微生物的Shannon 指數(shù) (H)、Simpson 指數(shù) (D) 和均勻度指數(shù)(E)(表3)，分別表征微生物群落的豐富度、優(yōu)勢度和均勻度。青龍山入侵帶土壤固氮微生物的三個多樣性指數(shù)在毛竹入侵影響下均無顯著變化；石門洞和進山門的Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)在原林地中最高，毛竹純林中最低，Simpson指數(shù)的變化相反，其中石門洞的變化顯著 (P＜0.05)。

2.4 毛竹入侵對土壤固氮微生物豐度的影響

圖1 三個入侵帶土壤nifH基因T-RFs (bp) 相對豐度Fig.1 Relative abundance of T-RFs (bp) of soil nifH genes in the three invasion belts[注（Note）：BB—毛竹林 Bamboo forest; BBBL—毛竹闊葉混交林 Mixed forest of bamboo and broadleaf or needle;BL—闊葉林 Broadleaf or needle forest.]

表2 三個入侵帶不同林分土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的多響應(yīng)置換過程分析Table2 Multi-response permutation procedure analysis of soil nitrogen-fixing microbes community structure between vegetation and invasion belts

表3 三個入侵帶土壤nifH基因多樣性指數(shù)Table3 Biodiversity indices of soil nitrogen-fixing microbes community in the three invasion belts

如圖2顯示，青龍山、石門洞和進山門入侵帶的土壤 nifH 基因拷貝數(shù)分別為 2.68 × 107～3.48 ×107、3.59 × 107～4.52 × 107和 4.45 × 107～11.9 × 107copies/g干土，進山門入侵帶土壤nifH基因豐度高于其他兩個。隨著毛竹入侵，土壤nifH基因豐度均呈下降趨勢 (BB＜BBBL＜BL)，但顯著差異只存在于進山門的毛竹林與混交林之間 (P＜0.05)，而青龍山和石門洞的nifH基因豐度在三種林分中均無顯著性差異。

2.5 土壤固氮微生物與土壤化學性質(zhì)的關(guān)系

圖2 三個入侵帶土壤nifH基因拷貝數(shù)Fig.2 Soil nifH gene copies in three invasion belts[注（Note）：BB—毛竹林 Bamboo forest; BBBL—毛竹闊葉混交林 Mixed forest of bamboo and broadleaf or needle; BL—闊葉林Broadleaf or needle forest.方柱上不同字母表示同一入侵帶不同林分間差異顯著 (P＜0.05) Different letters above the bars indicate significant differences among different forest types in the same invasion belt (P＜0.05).]

將三個入侵帶土壤固氮微生物的nifH基因豐度、多樣性指數(shù)分別與土壤化學性質(zhì)作相關(guān)性分析，表4列出了有顯著性差異的部分，青龍山入侵帶的土壤固氮微生物的各項指標中，僅均勻度指數(shù)與土壤硝態(tài)氮含量有顯著的相關(guān)性；石門洞的三個多樣性指數(shù)均與土壤有機碳含量有顯著相關(guān)性，與有效磷含量有極顯著相關(guān)性；進山門僅nifH基因豐度與有效磷含量有顯著相關(guān)性，與速效鉀含量有極顯著相關(guān)性。

將三個入侵帶土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤化學性質(zhì)分別和綜合進行冗余分析，結(jié)果如圖3所示，土壤化學性質(zhì)對青龍山和進山門 (圖3a、圖3c)兩個入侵帶土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)變異的影響均不顯著，且不同林分之間未形成明顯的聚類差異；石門洞入侵帶中 (圖 3b)，速效鉀 (F = 3.963，P =0.003) 和銨態(tài)氮 (F = 2.248，P = 0.049) 含量顯著影響該入侵帶土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的變異；合并三個入侵帶的土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)信息和土壤化學性質(zhì)的RDA結(jié)果表明 (圖3d)，有三個土壤性質(zhì)達到顯著水平，分別是堿解氮 (F = 3.016，P = 0.004)、有效磷 (F = 2.671，P = 0.024) 和速效鉀 (F = 2.838，P = 0.005) 含量，說明它們是毛竹入侵過程中土壤總固氮微生物群落結(jié)構(gòu)變異的主要影響因素。綜合以上結(jié)果，可以看出不同入侵帶之間沒有統(tǒng)一的規(guī)律性分布格局，可能與入侵帶的土壤性質(zhì)、植被類型等不同有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

土壤作為植物生長的介質(zhì)，能夠提供植物生長繁殖所需的水分和養(yǎng)分[30]，反之，植物也能夠?qū)ν寥赖男再|(zhì)產(chǎn)生影響[31]。植物入侵改變了植被組成，不同植物對土壤養(yǎng)分的差異吸收，以及林地的凋落物質(zhì)[32]、根系分泌物[33]等隨之發(fā)生改變，從而改變土壤的性質(zhì)。本研究結(jié)果表明，在毛竹入侵周邊闊葉林以及針闊混交林過程中，三個入侵帶土壤的pH值均有上升趨勢，而速效鉀含量均有所下降，這與已有的研究結(jié)果一致[16–17,20]，其中，毛竹對于土壤鉀素的偏好吸收可能是引起速效鉀下降的原因[34]，而不同營養(yǎng)元素以及根系分泌物組成的改變可能引起了土壤pH值的上升。在毛竹入侵過程中，雖然多種類的闊葉樹或針葉樹被單一的毛竹所替代，但毛竹具有較強的固碳能力[4]以及擁有大量的地下凋落物[35]，因此出現(xiàn)本文有機碳量隨毛竹入侵過程增加的現(xiàn)象。無機氮成分—硝態(tài)氮和銨態(tài)氮之間含量相近，銨態(tài)氮有顯著上升的情況，這與宋慶妮等[36]毛竹擴張對無機氮影響較小，且銨態(tài)氮是主要組分的研究結(jié)果有所差異，可能與研究區(qū)域本身氮素含量不同有關(guān)。三個入侵帶的有效磷含量在毛竹入侵后有上升的現(xiàn)象，可能與pH值的上升有關(guān)，磷素在酸性土壤尤其是pH＜5的環(huán)境中，容易形成Fe-P、Al-P等難溶性物質(zhì)[37]，降低土壤中有效磷含量?？傮w上，各個入侵帶的土壤養(yǎng)分含量在毛竹入侵后有所上升，說明毛竹入侵并不一定只單純地對生態(tài)系統(tǒng)造成危害。

表4 三個入侵帶土壤nifH基因豐度和多樣性指數(shù)與土壤化學性質(zhì)的相關(guān)性分析Table4 Correlation analysis between nifH gene abundance, diversity indices and soil chemical properties in the three invasion belts

圖3 土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤化學性質(zhì)的冗余分析Fig.3 RDA of soil nitrogen-fixing microbes community and soil chemical properties[注（Note）：BB—毛竹林 Bamboo forest；BBBL—毛竹原林混交林 Mixed forest of bamboo and broadleaf or needle；BL—原林地 Broadleaf or needle forest；SOC—土壤有機碳 Soil organic carbon；AN—堿解氮 Available nitrogen；AP—有效磷 Available phosphorus；AK—速效鉀Available potassium.]

土壤為微生物生長提供主要的養(yǎng)分和能量，土壤環(huán)境的變化導(dǎo)致微生物生物量的變化[38]，而不同植物類型、生長階段、基因型以及植物多樣性等則可直接影響或通過改變土壤環(huán)境間接影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)、多樣性和活性[39]。植物入侵過程中植物的組成及多樣性均發(fā)生變化，戴蓮等[40]發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭的入侵提高了土壤中固氮菌和氨氧化細菌等有益功能細菌的種群數(shù)量，Xu等[17]發(fā)現(xiàn)毛竹入侵天然闊葉林地后土壤微生物生物量和細菌多樣性上升，但利用碳源的功能多樣性沒有發(fā)生變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛竹入侵原有林分后土壤固氮微生物功能基因豐度呈下降趨勢，而土壤固氮微生物的豐富度、優(yōu)勢度和均勻度僅在石門洞有顯著變化。對固氮微生物來說，固氮過程會消耗大量用于生長的能源物質(zhì)[41]，偏好養(yǎng)分充足的土壤[42]，一般認為固氮微生物數(shù)量與有機質(zhì)含量呈正相關(guān)[43]，雖然土壤氮素含量與有機質(zhì)含量呈正相關(guān)，但土壤氮素含量并不與固氮微生物數(shù)量有正相關(guān)性，因為其中高濃度的無機態(tài)氮素對固氮菌生長反而具有抑制性[44]。毛竹替代原林后固氮微生物豐度下降，可能是毛竹林有效氮 (堿解氮和銨態(tài)氮) 增加對土壤固氮細菌生長起到抑制作用，而土壤速效鉀下降可能是另一誘因。土壤固氮微生物nifH豐度與土壤化學性質(zhì)之間的顯著相關(guān)性只發(fā)生在進山門入侵帶 (nifH基因豐度分別與有效磷顯著負相關(guān)、與速效鉀極顯著正相關(guān)) 的結(jié)果說明，固氮微生物與土壤性質(zhì)的關(guān)系比較復(fù)雜。畢江濤等[39]指出，土壤微生物多樣性與植物多樣性呈正相關(guān)，毛竹入侵后改變了植物多樣性，尤其是喬木層物種多樣性降低[15]，使得一部分固氮微生物種類消失 (土壤固氮微生物豐富度下降，表3)，這可能是導(dǎo)致固氮微生物豐度下降的原因。同時，闊葉樹或者針闊混交林被單一的毛竹取代后，嗜好毛竹凋落物和根系分泌物的固氮微生物種類增加，可解釋毛竹入侵后土壤固氮微生物豐富度下降和優(yōu)勢度上升的現(xiàn)象，這與王紀杰[45]研究發(fā)現(xiàn)竹葉加入到闊葉林土壤中，導(dǎo)致微生物利用碳源的功能多樣性指數(shù)隨時間延長下降，微生物群落逐漸簡單化的結(jié)果類似。本研究中毛竹入侵取代原樹種形成毛竹純林，與沈秋蘭等[46]的闊葉林改種為毛竹純林情況相似，兩個研究中闊葉林與毛竹林土壤pH和有機碳之間的差異類似，但土壤固氮細菌豐度變化與本研究結(jié)果相反。兩個研究中闊葉林與毛竹林之間土壤速效鉀和有效磷的變化正好相反，可能是引起結(jié)果不同的原因。從表4三個入侵帶中土壤性質(zhì)與功能基因豐度及固氮微生物多樣性的相關(guān)關(guān)系結(jié)果完全不一致，可以證明毛竹入侵過程中影響固氮微生物的因素比較復(fù)雜。這一結(jié)論可以從RDA結(jié)果得到進一步證明，三個入侵帶土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤化學性質(zhì)關(guān)系各不相同，僅石門洞入侵帶有顯著影響因子 (銨態(tài)氮和速效鉀)，并且土壤化學性質(zhì)對這三個入侵帶的土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)變化的解釋度較低，說明在本研究的三個入侵帶中，土壤性質(zhì)對土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)影響度不高，還需結(jié)合其他因素進行探討。

從T-RFLP圖譜的片段組成看 (圖1)，進山門入侵帶與其他兩個入侵帶差異明顯，可能因為進山門土壤母質(zhì)主要為石英斑巖，屬于花崗巖類，而其他兩地主要為泥質(zhì)灰?guī)r，屬于碳酸鹽巖類，兩者在化學性質(zhì)上并不相同[47]，導(dǎo)致土壤的化學性質(zhì)存在差異(表1)。三個入侵帶的共同優(yōu)勢片段48 bp在進山門入侵帶中相對比例明顯較低，而毛竹入侵后變化卻很大。董志新等[48]發(fā)現(xiàn)農(nóng)田的不同土壤類型是影響土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著影響因子。MRPP分析表明，毛竹入侵形成的三個林分之間土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)變化沒有一致規(guī)律，石門洞和進山門入侵帶不同林分之間的土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著變異，而青龍山入侵帶則變異不顯著。張于光等[49]研究發(fā)現(xiàn)高寒草甸、高寒草原和高寒森林的土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)具有明顯的差異，而文都日樂等[50]研究草原土壤固氮微生物時，發(fā)現(xiàn)土壤固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)在不同草地類型間的差異同樣顯著，說明植被是影響土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素。青龍山毛竹入侵前后差異不顯著，可能與其原有林地是針闊混交林有關(guān)，而石門洞和進山門入侵帶是闊葉林。三個入侵帶土壤固氮微生物的共同MRPP分析進一步證明，位于同一自然保護區(qū)的三個入侵帶的土壤微生物之間有著極顯著差異。概括分析得知，同為泥質(zhì)灰?guī)r的石門洞和青龍山入侵帶，石門洞毛竹入侵后土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著變異，而青龍山則變化不明顯；發(fā)育于石英斑巖的進山門入侵帶土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與石門洞和青龍山入侵帶明顯不同、入侵過程中土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)變化明顯；以上結(jié)果說明，天目山毛竹入侵過程中土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的變化是土壤性質(zhì) (取決于母巖) 和植被交互作用的結(jié)果。

以上研究表明，即使同一自然保護區(qū)的三個毛竹入侵帶，顯著影響土壤固氮微生物群落變化的土壤化學性質(zhì)并不相同。土壤母質(zhì)和原有植被組成的綜合作用導(dǎo)致土壤固氮微生物群落發(fā)生變化。因此，毛竹入侵周邊林地導(dǎo)致的土壤化學性質(zhì)以及固氮微生物的變化機制比較復(fù)雜，需要多層次、多尺度地來探討毛竹入侵對土壤固氮微生物的影響。