復(fù)合氨基酸肥料增效劑對NaCl脅迫下小白菜種子萌發(fā)和苗期生長的影響

許 猛，袁 亮，李 偉，李燕婷，李 娟，趙秉強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，北京 100081）

種子萌發(fā)質(zhì)量和幼苗生長狀況的優(yōu)劣決定了作物后續(xù)發(fā)育時期的生長質(zhì)量乃至產(chǎn)量的高低，然而作物種子萌發(fā)期和幼苗期也是抵抗外界逆境脅迫最弱的時期[1–4]。在鹽堿土和高鹽分灌溉水環(huán)境中，鹽害尤其是NaCl對種子萌發(fā)和幼苗的影響非常大，并且隨著NaCl濃度的升高，其對作物種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用越來越強(qiáng)[5–6]。在評價作物耐鹽能力和篩選耐鹽品種時，種子萌發(fā)期和苗期也是必要或決定性的階段[7–10]。除種植耐鹽品種外，使用有效的外源物質(zhì)也是減輕鹽害的重要手段[11–12]。氨基酸作為一類肥料增效物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)作物生長發(fā)育、提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)、提高肥料利用率和減少環(huán)境風(fēng)險等多重增效作用[13–17]。最近研究[18–22]表明，氨基酸類物質(zhì)作為一種植物生物刺激素還能改善植物的生理特性，顯著提高植物耐鹽性，緩解鹽脅迫對植物生長發(fā)育的抑制程度。Ertani等[18]發(fā)現(xiàn)由紫花苜蓿制得的蛋白水解物能夠誘導(dǎo)抗鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，降低玉米幼苗葉片Na+含量，減輕鹽脅迫對幼苗生長發(fā)育的抑制癥狀，從而改善玉米的生理特性，促進(jìn)玉米幼苗生長。Lucini等[19]利用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下植物蛋白水解物 (商品名Trainer)能夠通過誘導(dǎo)植物體內(nèi)多種激素的表達(dá)、改善氮代謝、提高光化學(xué)PSII系統(tǒng)作用、緩解膜過氧化程度和刺激細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)表達(dá)等多種生理生化過程，促進(jìn)生長發(fā)育，增強(qiáng)葉片光合作用，從而提高生菜產(chǎn)量、改善生菜品質(zhì)，緩解鹽脅迫傷害。Mostafa[20]的試驗同樣證明，在鹽脅迫下混合氨基酸能夠促進(jìn)茴香生長和干物質(zhì)積累，顯著提高茴香品質(zhì)和單果重，減輕受鹽害脅迫的程度。

谷氨酸尾液含有豐富的游離氨基酸。但由于谷氨酸尾液中Na+含量較高，不同工藝、高濃度的谷氨酸尾液直接使用有時還會加重鹽害[16,23]，所以利用谷氨酸尾液進(jìn)行的抗鹽脅迫研究較少。復(fù)合氨基酸肥料增效劑 (專利號：ZL201410026086.5) 是將谷氨酸尾液經(jīng)濃縮脫鹽等工藝技術(shù)制得，為谷氨酸尾液的資源化利用提供了新途徑。本試驗研究了在NaCl脅迫下，復(fù)合氨基酸肥料增效劑對小白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，以明確該氨基酸類物質(zhì)緩解鹽脅迫的性能，為其在鹽堿土地區(qū)的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試作物：不結(jié)球白菜 (Brassica chinensis L.)，品名‘上海青’。

復(fù)合氨基酸肥料增效劑 (以下簡稱增效劑)：游離氨基酸含量15.4%，以谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、天冬氨酸為主；Na+含量1.2%。

1.2 試驗設(shè)計與測定

1.2.1 萌發(fā)試驗 挑選整齊飽滿的小白菜種子用 10%NaClO消毒15分鐘后，用滅菌蒸餾水沖洗3次，吸去多余水分后分別用不同濃度復(fù)合氨基酸肥料增效劑浸種12 h。增效劑濃度分別設(shè)置為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L，代碼分別為 Z0、 Z0.05、 Z0.1、Z0.2、Z0.4、Z0.8。浸種完后，再用蒸餾水沖洗3次，吸去多余水分。將浸種后的種子均勻擺入鋪有2層無菌濾紙的9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，分別加入5 mL 含 0、25、50、75 mmol/L NaCl的鹽液后，置于25℃人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，試驗期間以稱重法補(bǔ)充蒸餾水，每皿50粒，重復(fù)4次，對照為不含NaCl的蒸餾水。從發(fā)芽初始，每天記錄種子發(fā)芽數(shù) (以胚芽達(dá)到種子長度的一半以上或胚根達(dá)到種子長度為發(fā)芽)，第2天計算發(fā)芽勢；第4天結(jié)束試驗并計算發(fā)芽率，測定胚根長、胚芽長。發(fā)芽勢 (%) = 前2天總發(fā)芽數(shù)/供測種子總數(shù) × 100；發(fā)芽率 (%) = 前4天總發(fā)芽數(shù)/供測種子總數(shù) × 100。

1.2.2 苗期試驗 采用穴盤育苗，待長到2葉1心時選擇整齊良好的小白菜幼苗，移至含有1/2 改良Hoagland’s營養(yǎng)液中緩苗。兩天后，同時加入NaCl和增效劑到全Hoagland’s 營養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)pH到6.30，各處理營養(yǎng)液電導(dǎo)率見表1。增效劑濃度設(shè)置為 0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L，代碼分別為Z0、Z0.05、Z0.1、Z0.2、Z0.4、Z0.8；鹽 (NaCl) 濃度設(shè)置為0、25、50、75 mmol/L，對照為不含NaCl的營養(yǎng)液。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)培養(yǎng)3棵幼苗。每天更換一次營養(yǎng)液。培養(yǎng)10天后，進(jìn)行指標(biāo)測定。

表1 各處理營養(yǎng)液電導(dǎo)率 (μS/cm)Table1 The electrical conductivity values of nutrient solution in different treatments

測定根長 (最長根)、株高 (地上部全長)、鮮重(地上部和地下部之和)；最大葉片SPAD值采用日本產(chǎn)SPAD-502葉綠素儀測定；葉片超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用氮藍(lán)四唑光化學(xué)還原法[24]測定，過氧化物酶 (POD) 活性采用愈創(chuàng)木酚法[24]測定，過氧化氫酶 (CAT) 活性采用紫外線吸收法[25]測定，所有酶活性單位以樣品鮮重為基準(zhǔn)；丙二醛 (MDA) 含量采用硫代巴比妥酸法[25]，葉片超氧陰離子自由基 ()產(chǎn)生速率采用羥胺氧化法[25]測定，脯氨酸 (Pro) 含量采用磺基水楊酸法[26]測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用 Excel 2013、DPS 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合氨基酸肥料增效劑對NaCl脅迫下小白菜種子萌發(fā)的影響

由表2可以看出，NaCl濃度越高對Z0 (蒸餾水浸種) 處理的小白菜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率抑制作用越強(qiáng)。在對照條件 (0 mmol/L NaCl) 下，增效劑本身對小白菜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率表現(xiàn)出了抑制作用，且增效劑濃度增加到0.4 g/L時抑制作用均達(dá)到顯著水平。而在 25、50、75 mmol/L NaCl鹽脅迫下，小白菜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率隨增效劑濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且均以Z0.2效果最佳。

表2 不同NaCl脅迫水平下復(fù)合氨基酸肥料增效劑對小白菜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響Table2 Potential and percentage of germination of pakchoi seeds under different NaCl stress and fertilizer synergist addition levels

由表3可以看出，NaCl濃度越高，對Z0處理小白菜種子胚根和胚芽的抑制作用越強(qiáng)。增效劑本身同樣具有抑制作用，其對胚根長和胚芽長的抑制分別在0.4 g/L和0.2 g/L時達(dá)到顯著水平。在25、50、75 mmol/L NaCl脅迫下，小白菜種子胚根長和胚芽長均隨增效劑濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，增效劑濃度達(dá)到0.1～0.2 g/L時效果最好。

表3 不同NaCl脅迫水平下復(fù)合氨基酸肥料增效劑對小白菜胚根長和胚芽長的影響Table3 Radical and plumular lengths of pakchoi under different NaCl stress and fertilizer synergist addition levels

2.2 復(fù)合氨基酸肥料增效劑對NaCl脅迫下小白菜生長的影響

圖1 不同NaCl脅迫水平下復(fù)合氨基酸肥料增效劑對小白菜鮮重的影響Fig.1 Fresh biomass weight of pakchoi under different NaCl stress and fertilizer synergist addition levels[注（Note）：柱上不同字母表示相同NaCl濃度下不同處理間差異達(dá) 0.05 顯著水平 Different letters above the bars are significantly different at 5% level among the treatments at the same NaCl concentration.]

由圖1可以看出，隨NaCl濃度上升，Z0處理小白菜鮮重呈現(xiàn)直線降低的趨勢。在對照條件下Z0.1處理小白菜鮮重最高，在25、50、75 mmol/L NaCl鹽脅迫條件下均以Z0.05處理小白菜鮮重最高，增幅分別達(dá)34.2%、36.2%和19.3%；之后隨增效劑濃度繼續(xù)增加，各鹽濃度條件下鮮重均持續(xù)下降，在Z0.4或Z0.8處理時達(dá)到顯著水平。

由圖2可以看出，NaCl濃度越高，Z0處理葉片SPAD值越低。在對照條件下，Z0.05處理對提高葉片SPAD值效果最好，隨增效劑濃度繼續(xù)增加，SPAD值呈下降趨勢，在0.4 g/L時差異顯著。在25、50、75 mmol/L NaCl脅迫下，葉片 SPAD 值最高處理也是Z0.05，隨增效劑濃度增加SPAD值下降更快，在0.2 g/L時均已達(dá)差異顯著水平。

圖2 不同NaCl脅迫水平下復(fù)合氨基酸肥料增效劑對小白菜SPAD值的影響Fig.2 SPAD value of pakchoi under different NaCl stress and fertilizer synergist addition levels[注（Note）：柱上不同字母表示相同NaCl濃度下不同處理間差異達(dá) 0.05 顯著水平 Different letters above the bars are significantly different at 5% level among the treatments at the same NaCl concentration.]

由表4可以看出，在 0～75 mmol/L NaCl脅迫條件下，除Z0.05處理小白菜根長與Z0處理基本持平外，其余增效劑處理均抑制了根的伸長，而株高呈先上升后下降的趨勢。在對照條件下， Z0.1處理效果最好，株高增加19.9%；在25、50 mmol/L NaCl脅迫下，均以Z0.05處理小白菜株高最高，分別增加23.1%和19.5%，之后隨增效劑濃度增加株高迅速降低；在75 mmol/L NaCl濃度下，Z0.1處理效果最好，但各處理之間差異均不顯著。

2.3 復(fù)合氨基酸肥料增效劑對NaCl脅迫下小白菜葉片抗氧化酶活性的影響

由表5可以看出，NaCl濃度越高對Z0處理葉片SOD活性抑制越強(qiáng)烈。在對照條件下，與Z0處理相比，SOD活性差異均不顯著，以Z0.8處理活性最低。在25～75 mmol/L NaCl脅迫條件下，隨增效劑濃度提高小白菜SOD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律，且均以Z0.1處理最高，而高濃度增效劑尤其是Z0.8處理會抑制SOD活性。在0～75 mmol/L NaCl范圍內(nèi)，各濃度增效劑均能保持或提高小白菜葉片POD活性，Z0.05處理對提高葉片POD活性效果最好。對于葉片CAT活性，在0～75 mmol/L NaCl脅迫下，同樣均以Z0.05處理酶活性最高，之后隨增效劑濃度提高，CAT活性均有所下降，但均高于Z0處理或與Z0處理持平。在各鹽濃度條件下，Z0.05處理對于提高三種酶活性方面表現(xiàn)突出，Z0.8處理效果最差。

表4 不同NaCl脅迫水平下復(fù)合氨基酸肥料增效劑對小白菜根長和株高的影響Table4 Root and shoot lengths of pakchoi under different NaCl stress and fertilizer synergist addition levels

2.4 復(fù)合氨基酸肥料增效劑對NaCl脅迫下小白菜苗期葉片活性氧和丙二醛含量的影響

表5 不同NaCl脅迫水平和復(fù)合氨基酸肥料增效劑對小白菜葉片SOD、POD和CAT活性的影響Table5 SOD, POD and CAT activity of pakchoi leaves under different NaCl stress and fertilizer synergist addition levels

2.5 復(fù)合氨基酸肥料增效劑對NaCl脅迫下小白菜苗期葉片脯氨酸含量的影響

由圖3可以看出，隨NaCl濃度的上升，葉片Pro含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。增效劑本身能夠促進(jìn)Pro積累，增幅達(dá)31.4%～66.0%。在25、50 mmol/L NaCl脅迫下，Z0.05和Z0.1處理能夠保持葉片Pro含量，之后隨增效劑濃度繼續(xù)增加會使Pro濃度顯著下降。在75 mmol/L NaCl脅迫下Pro含量變化不一。

表6 不同NaCl脅迫水平和復(fù)合氨基酸肥料增效劑對小白菜葉片產(chǎn)生速率和MDA含量的影響Table6 producing rate and MDA concentration in pakchoi leaves under different NaCl stress and fertilizer synergist addition levels

表6 不同NaCl脅迫水平和復(fù)合氨基酸肥料增效劑對小白菜葉片產(chǎn)生速率和MDA含量的影響Table6 producing rate and MDA concentration in pakchoi leaves under different NaCl stress and fertilizer synergist addition levels

注（Note）：數(shù)據(jù)后不同字母表示相同 NaCl 濃度不同處理間差異達(dá) 0.05 顯著水平 Values followed by different small letters are significantly different at the same NaCl concentration at 5% levels.

項目Item處理Treatment NaCl (mmol/L)0 25 50 75產(chǎn)生速率producing rate[mol/(g·min),FW]Z0 0.28 ab 0.32 ab 0.44 abc 0.49 c Z0.05 0.20 b 0.26 b 0.36 c 0.55 bc Z0.1 0.27 ab 0.31 b 0.39 bc 0.54 bc Z0.2 0.26 ab 0.35 ab 0.51 ab 0.62 ab Z0.4 0.27 ab 0.37 ab 0.56 a 0.61 ab Z0.8 0.38 a 0.45 a 0.52 a 0.71 a Z0 3.17 b 2.98 b 4.30 ab 4.43 bc Z0.05 2.84 b 1.91 c 3.45 c 4.10 cd Z0.1 3.17 b 2.18 bc 3.94 b 3.91 d Z0.2 5.29 a 2.78 bc 4.00 ab 4.71 b Z0.4 4.33 a 2.87 b 4.26 ab 5.94 a Z0.8 4.93 a 3.91 a 4.32 a 5.95 a MDA含量MDA content(μmol/g,FW)

圖3 不同NaCl脅迫水平和復(fù)合氨基酸肥料增效劑對小白菜葉片脯氨酸含量的影響Fig.3 Pro concentration of pakchoi leaves under different NaCl stress and fertilizer synergist addition levels[注（Note）：柱上不同字母表示同一NaCl濃度下不同處理間差異達(dá) 0.05 顯著水平 Different letters above the bars are significantlydifferent at 5% level among the treatments at the same NaCl concentration.]

3 討論

3.1 復(fù)合氨基酸肥料增效劑對NaCl脅迫下小白菜種子萌發(fā)的影響

在無 NaCl脅迫條件下，低濃度 (≤ 0.2 g/L) 增效劑會輕微抑制種子萌發(fā)，濃度超過0.2 g/L會明顯抑制種子萌發(fā) (表2、表3)。這是由于增效劑含有一定量的鹽分 (表1)，用量過高也會導(dǎo)致鹽害，其電導(dǎo)率比25 mmol/L NaCl的低，而抑制種子萌發(fā)的作用更強(qiáng)烈，可能是過高濃度的氨基酸對種子萌發(fā)起了抑制作用。李友勇等研究表明，多種外源氨基酸在高濃度下均會強(qiáng)烈抑制多種作物種子萌發(fā)[27,28]。

在無NaCl脅迫條件下，增效劑雖然對小白菜種子萌發(fā)無促進(jìn)作用，但在鹽脅迫條件下，適宜濃度(≤ 0.2 g/L) 的增效劑卻促進(jìn)了種子發(fā)芽，提高了發(fā)芽質(zhì)量 (表2、表3)，這與沙漢景[29]在水稻種子上的研究一致。其原因很可能是在鹽脅迫條件下，NaCl對種子造成的滲透脅迫和離子毒害導(dǎo)致蛋白酶等代謝不正常，而適宜外源氨基酸在浸種過程中隨種子吸水作用進(jìn)入種子內(nèi)部，不僅可以提高種子蛋白酶、淀粉酶的活性，還可以降低細(xì)胞內(nèi)的滲透勢，緩解滲透脅迫，從而維持正常萌發(fā)過程[30,31]。此外，種子萌發(fā)時的代謝強(qiáng)度與細(xì)胞質(zhì)膜的完整性密切相關(guān)，氨基酸在提高種子抗氧化酶活性和緩解鹽脅迫下活性氧積累對細(xì)胞質(zhì)膜的傷害方面發(fā)揮了作用[32,33]。很多研究表明[29,33–35]，在鹽脅迫下外源氨基酸浸種提高了種子萌發(fā)質(zhì)量，萌發(fā)的種子繼續(xù)培養(yǎng)到苗期乃至整個生育期依然會表現(xiàn)出良好的抗逆境脅迫能力，其原因是在有效外源物質(zhì)中浸種“激活”了耐鹽能力，使作物提前適應(yīng)了逆境脅迫環(huán)境[7–11]。

3.2 復(fù)合氨基酸肥料增效劑對NaCl脅迫下小白菜幼苗生長的影響

無鹽脅迫條件下，增效劑對小白菜幼苗生長的影響存在濃度效應(yīng)：高濃度 (≥ 0.4 g/L) 抑制幼苗生長，而低濃度 (0.1 g/L) 則能夠促進(jìn)幼苗生長 (圖 1)。研究表明，多種外源氨基酸除能夠被作物直接吸收提供有機(jī)碳、氮營養(yǎng)外，還能夠刺激作物生長、調(diào)控體內(nèi)代謝，從而促進(jìn)植株生長發(fā)育，但濃度高則會抑制作物生長[36–39]。

葉是光合作用的主要器官，高濃度NaCl會嚴(yán)重破壞植物葉片的結(jié)構(gòu)和功能，使得葉綠素含量下降，減弱葉片的光合作用[11,40–41]。植物葉首先受到傷害的是細(xì)胞膜，鹽脅迫下葉片產(chǎn)生速率加快，MDA含量升高。等活性氧積累會誘發(fā)膜脂過氧化使細(xì)胞表現(xiàn)出脫脂化現(xiàn)象，MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，兩者含量升高均表明細(xì)胞膜受損，導(dǎo)致離子外滲[11,40]；MDA還會引起生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等的交聯(lián)聚合，引起代謝紊亂[41]。鹽脅迫產(chǎn)生的離子毒害作用還會對葉片光系統(tǒng)II反應(yīng)中心造成損傷，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，引起葉綠素降解，使光合電子傳遞和PSII的光合作用活力被抑制，從而減弱光合作用，使得物質(zhì)和能量積累不足，抑制植株生長[11,41]。

在鹽脅迫下，適宜濃度增效劑能夠提高葉片葉綠素含量，增強(qiáng)幼苗光合作用，促進(jìn)莖伸展和根伸長，增加幼苗鮮重，促進(jìn)小白菜正常生長發(fā)育。研究表明[33–35,42–44]，在 NaCl脅迫下，外源氨基酸可以通過抗氧化酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)途徑提高植物體耐鹽能力，促進(jìn)植物生長。SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的主要成員，能夠清除植物體內(nèi)的活性氧[11–12]；植物體內(nèi)的脯氨酸可以保持細(xì)胞原生質(zhì)與外界環(huán)境滲透平衡，是植物鹽脅迫下積累的最重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，脯氨酸還能夠作為逆境脅迫信號物質(zhì)，誘導(dǎo)抗鹽基因的表達(dá)，穩(wěn)定和保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，參與氮代謝和自由基的清除[11–12,19]。本試驗中，0.05 g/L增效劑能夠提高小白菜葉片SOD、POD和CAT活性，降低葉片MDA含量和產(chǎn)生速率，并維持脯氨酸含量，提高小白菜幼苗耐鹽能力，從而減輕NaCl對小白菜的傷害程度，維持正常光合作用，說明增效劑可以通過提高抗氧化酶活性和維持滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量提高小白菜幼苗的抗鹽能力。

4 結(jié)論

1) 無鹽脅迫條件下，低濃度 (≤ 0.2 g/L) 復(fù)合氨基酸肥料增效劑輕微抑制種子萌發(fā)，高濃度增效劑(0.4 g/L、0.8 g/L) 顯著抑制種子萌發(fā)。在鹽 (NaCl 25、50、75 mmol/L ) 脅迫條件下，低濃度 (≤ 0.2 g/L)復(fù)合氨基酸肥料增效劑可明顯緩解鹽脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用。

2) 無鹽脅迫條件下，適宜濃度復(fù)合氨基酸肥料增效劑可促進(jìn)小白菜幼苗生長，濃度以0.1 g/L最佳，之后隨增效劑濃度的增加抑制生長作用增強(qiáng)。在鹽(NaCl25、50、75 mmol/L) 脅迫條件下，低濃度復(fù)合氨基酸肥料增效劑可通過提高小白菜幼苗葉片抗氧化酶活性和維持滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量，緩解鹽對幼苗生長的脅迫，但隨增效劑濃度增加抑制生長作用加強(qiáng)，最適使用濃度為 0.05 g/L。