基于3D打印的血型檢測(cè)微流控芯片研究

許 雪， 陳 曦， 趙佳敏， 張自力， 李永猛

(河北工業(yè)大學(xué)人工智能與數(shù)據(jù)科學(xué)學(xué)院，天津 300130)

0 引 言

隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，臨床血型即時(shí)檢測(cè)工作日益繁重。匹配錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重后果，因此必須保證獻(xiàn)血與輸血間血型的一致性。微柱凝膠檢測(cè)法[1]是目前國際衛(wèi)生組織特別推薦的方法，較之傳統(tǒng)玻片法、試管法，其靈敏度可提高10倍以上，結(jié)果穩(wěn)定便于檢測(cè)。微流控芯片技術(shù)具備微量、高通等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)在微升級(jí)別上的集成分析以及各項(xiàng)操作與功能[2]，檢測(cè)過程易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、批量化、高效化、精度化，被廣泛用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、基因分析、細(xì)胞篩選等眾多領(lǐng)域[3-4]。為提高檢測(cè)精度，對(duì)使用的微流控芯片具有較高的要求。然而，微流裝置的微細(xì)加工需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，雖然存在相對(duì)便宜的制造技術(shù)，如聚合物基（PDMS）微細(xì)加工，其利用模具的光刻制造來制備芯片，微流通道開放，并需要熟練的專業(yè)人員。此外，紙基微流控芯片或試紙對(duì)環(huán)境條件敏感，且需要實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行批量生產(chǎn)，耗時(shí)耗力。而一臺(tái)3D打印機(jī)，可將多步驟集成到一個(gè)按鈕中，能達(dá)到快速制備一張密閉高通流道微流控芯片的目的，通道更安全、可靠。同時(shí)，微流控芯片需要相對(duì)精確的3D打印，而現(xiàn)有大部分3D打印機(jī)中，F(xiàn)DM（熔融沉積型）精度不夠，SLA（光固化）精度達(dá)到，但價(jià)格較高。液晶掩模（LCD masking），能即時(shí)打印，但缺點(diǎn)是LCD屏易損易老化，可選范圍少，成本相對(duì)較高。因此，本文采用目前流行的一種基于面投影，逐層光固化的高精度數(shù)字光處理（digital light processing，DLP）3D打印技術(shù)，采用微升級(jí)工藝進(jìn)行微流控芯片的制備。較傳統(tǒng)制備方法，速度更快，通道精度更高；通道密閉，安全性能更好，同時(shí)相對(duì)于LCD成本更低，選擇范圍更廣，能滿足對(duì)血型的快速即時(shí)檢測(cè)要求。

3D打印技術(shù)制造方法便捷，同時(shí)擁有較高精度，已有很多研究將其應(yīng)用于微流控芯片的加工中[5]。如Spivey等[6]使用基于DLP技術(shù)的3D打印機(jī)加工了用于研究細(xì)胞衰老的微流控芯片，精度可達(dá)4 μm。然而，3D打印與醫(yī)學(xué)診斷芯片相結(jié)合的應(yīng)用還沒有得到很好地探索，尤其對(duì)于微升級(jí)3D打印微流控芯片的制備，在速度和精度方面還有待發(fā)展。因此，設(shè)計(jì)研究一種密閉微通道的用于血型檢測(cè)的3D微流控芯片很有必要。

1 方 法

1.1 DLP（數(shù)字光處理）3D打印技術(shù)

數(shù)字微鏡裝置的數(shù)字光處理（DLP）3D打印技術(shù)，較傳統(tǒng)的微立體光刻技術(shù)，打印速度和準(zhǔn)確度進(jìn)一步提高[5]。DLP工作原理，如圖1所示，在3D打印過程中，激光照射到一個(gè)由MEMS技術(shù)加工而成的微鏡陣列上，通過微鏡陣列對(duì)激光反射的控制（陣列角度±10°）達(dá)到選擇性曝光光刻膠的目的，通過面成型代替點(diǎn)成型，光強(qiáng)分布均勻，穩(wěn)定性強(qiáng)，同時(shí)可以達(dá)到工業(yè)級(jí)精度，大幅度減少打印時(shí)間，提高效率。

圖1 DLP 3D打印技術(shù)工作原理

在3D打印微流控芯片過程中，激光對(duì)光敏樹脂進(jìn)行曝光固化的同時(shí)，調(diào)節(jié)升降臺(tái)高度，采用下投影式，可動(dòng)態(tài)地創(chuàng)造出每一層的光學(xué)圖案，逐層打印，如圖2所示，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)3D微流控芯片的制備加工。

圖2 3D打印下投影式成型機(jī)原理圖

1.2 芯片的設(shè)計(jì)與制作

本文設(shè)計(jì)的血型檢測(cè)微流控芯片，使用桌面級(jí)3D打印機(jī)，直接將三維設(shè)計(jì)軟件AutoCAD的數(shù)字模型（輸出為stl格式文件），通過計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)換為特定厚度的截面數(shù)據(jù)，導(dǎo)入打印機(jī)，如圖3所示。實(shí)現(xiàn)芯片的制備，降低了人為因素誤差，更安全可靠。

圖3 微流控芯片打印流程圖

制備的微流控血型檢測(cè)芯片如圖4所示，尺寸為34 mm×33 mm×4 mm（長(zhǎng)×寬×高）。

圖4 血型檢測(cè)微流控芯片概念圖及實(shí)物圖

1.2.1 芯片微通道反應(yīng)腔結(jié)構(gòu)

芯片的主要部分即微流道反應(yīng)腔，該3D微流控芯片由6個(gè)規(guī)格相同的密閉微流通道反應(yīng)腔（簡(jiǎn)稱微流道）構(gòu)成，分別為抗A、抗B、抗Rh（D）、對(duì)照A、B、D。該微流道灌裝容積約為9 μL，要求灌入到血型卡每個(gè)微柱內(nèi)藥液均為7 μL。流道總長(zhǎng)16 mm，從采樣通道端口到入口儲(chǔ)液池呈階梯狀，長(zhǎng)度分別為4 mm，7 mm，5 mm，寬度分別為0.5 mm，1 mm，1.5 mm，深度分別為0.3 mm，0.5 mm，0.7 mm，每個(gè)單通道平面構(gòu)型設(shè)計(jì)如圖5所示，包括入口儲(chǔ)液池、試劑反應(yīng)腔、采樣通道3個(gè)主要模塊[7]，芯片微流道結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)三維示意圖見圖6。

圖5 芯片單通道平面構(gòu)型圖

1.2.2 微流控芯片的制備

本文使用DLP的3D打印機(jī)（閃鑄Hunter），通過直接將AutoCAD數(shù)字設(shè)計(jì)導(dǎo)入打印機(jī)，創(chuàng)建單個(gè)血型檢測(cè)微流控芯片，從而實(shí)現(xiàn)概念到芯片的制造。該項(xiàng)目所需材料還包括3D打印的耗材透明樹脂，氫氧化鉀（KOH），乙二醇，過氧化氫。打印完成后，用異丙醇清洗3D芯片，并用空氣壓縮機(jī)沖洗未固化的樹脂[8]。為了增大芯片材料的親水性[9]，進(jìn)一步提高微通道質(zhì)量，用0.1 mol/L KOH溶液活化樹脂，再將3D打印的微流控芯片浸入含有1.82 mol/L KOH的純乙二醇溶液中，在60℃下孵育2 h[9]，最后用水沖洗芯片，得到最終用于血型檢測(cè)的微流控芯片。

圖6 芯片微流道結(jié)構(gòu)示意圖（單位：mm）

1.3 微流控芯片檢測(cè)識(shí)別

1.3.1 檢測(cè)原理

基于微柱凝膠技術(shù)，采用正定型的方法進(jìn)行檢測(cè)，通過一次工序，在芯片入口儲(chǔ)液池灌入體積比為3:2的葡聚糖凝膠與抗體的膠液混合物，其凝膠介質(zhì)在50倍顯微鏡下如圖7所示。

圖7 凝膠型介質(zhì)顯微示意圖

加入樣本血液（每微通道約1 μL），采用離心機(jī)進(jìn)行高速離心2 min。通過圖像識(shí)別微流管道內(nèi)紅細(xì)胞凝集停留位置（如圖8所示）：抗原抗體發(fā)生凝集時(shí)，凝集的紅細(xì)胞停留在分離介質(zhì)上層（+），為陽性反應(yīng)；未發(fā)生凝集反應(yīng)的，所有紅細(xì)胞通過分離介質(zhì)間隙，在微流道底部聚集（-），為陰性反應(yīng)。最終，得到需要檢測(cè)的對(duì)應(yīng)血型。

圖8 微流道凝膠抗體與紅細(xì)胞抗原示意圖

1.3.2 檢測(cè)流程

采用實(shí)驗(yàn)室攝像機(jī)（型號(hào)：MV-EM200C，S/N：00464658），對(duì)微流控芯片進(jìn)行拍攝。圖9（a）、圖9（c）為以LED為背光，紅色光源攝像頭照射下的芯片通道實(shí)物圖。

將采集到的原始六通道圖像進(jìn)行剪裁，得到芯片單通道圖像，對(duì)圖像進(jìn)行灰度化、噪聲濾波，并進(jìn)行二值化處理得到二值圖，再通過Sobel算法[10]進(jìn)行邊緣處理（見圖9（b）），拾取反應(yīng)區(qū)形狀特征，采用質(zhì)心法得到質(zhì)心標(biāo)記圖（如圖10所示），以便更好地對(duì)血型檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別。最后，通過識(shí)別二維碼對(duì)微流控芯片進(jìn)行記錄，具體步驟如圖11所示。

2 結(jié)果與分析

3D打印質(zhì)量通過微觀結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡（SEM）成像來表征[7]，圖9（d）為3D打印的微流控芯片微通道SEM圖，顯示打印圖層細(xì)節(jié)（400 μm）。通過測(cè)試，血型檢測(cè)微流控芯片滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.1 芯片灌裝高度

采用微柱凝膠血型檢測(cè)法，對(duì)芯片微流道中試劑體積有嚴(yán)格要求，試劑過多或過少都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。因此灌裝后需檢測(cè)芯片的膠液混合相高度是否符合標(biāo)準(zhǔn)。

圖10 質(zhì)心標(biāo)記圖

圖11 血型檢測(cè)處理流程圖

在已有數(shù)據(jù)中，選擇了400張灌裝后芯片進(jìn)行高度測(cè)量。表1是部分芯片膠液混相高度數(shù)據(jù)。其中N為芯片序號(hào)，1-i為第1張卡的第i個(gè)（1≤i≤6）微柱管；M1為手工測(cè)量的膠液混相高度；P1為Sobel算法檢測(cè)得到的膠液混相高度；誤差E1=P1-M1；t為單張微流控芯片六微柱管高測(cè)量總耗時(shí)。

對(duì)2 000張所有采集的膠液混相高度誤差數(shù)據(jù)作誤差數(shù)據(jù)直方圖并擬合分布曲線進(jìn)行分析，如圖12所示，由圖像曲線可看出其分布近似于正態(tài)分布。

所以誤差概率密度函數(shù)可表示為

式中 μ為均值， σ為標(biāo)準(zhǔn)差。近似計(jì)算可得，μ=?0.0401，σ=0.0401。由 3σ原則知，數(shù)值分布在(μ?3σ,μ+3σ)中的概率為0.997 4，超出這個(gè)范圍的可能性不大于0.003，因此可以近似認(rèn)為膠液高度誤差在（–0.160 4，0.080 2）區(qū)間內(nèi)，符合膠液高度測(cè)量的精度要求。即3D打印的微流控芯片，通道打印均勻，質(zhì)量符合精度要求。

表1 血型檢測(cè)微流控芯片微柱高度測(cè)量數(shù)據(jù)

圖12 膠液混相高度誤差分布（n=2 000）

2.2 芯片血型識(shí)別

在微流控芯片中灌入7 μL葡聚糖凝膠與抗體膠液混合試劑，進(jìn)行獨(dú)立重復(fù)血型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)[11]。人工手動(dòng)識(shí)別作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)記為A，微流控芯片圖像識(shí)別記為B，實(shí)驗(yàn)樣本分別取A組（1 182片）、B組（1 409片）。其中，人工識(shí)別采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行滴定識(shí)別，而微流控芯片的血型檢測(cè)，通過圖像處理進(jìn)行識(shí)別，血型檢測(cè)識(shí)別結(jié)果見表2。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，微流控芯片圖像識(shí)別，可在1 200 ms左右完成單樣品圖像檢測(cè)，單張整體耗時(shí)3 min左右，較臨床實(shí)際需求的5～20 min耗時(shí)較短，且樣品識(shí)別率提高至99.29%。

表2 微流控芯片血型檢測(cè)樣本識(shí)別

3 結(jié)束語

本文采用基于DLP的光固化3D工藝技術(shù)，設(shè)計(jì)制備了一種用于快速檢測(cè)血型的微流控芯片，利用該微流控芯片，對(duì)人體血液進(jìn)行采樣檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)血型檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明該芯片成功檢測(cè)出樣品血型種類，且檢測(cè)成功率較高，整個(gè)過程耗時(shí)較短，具有易于操作、成本低、試劑消耗少、快速即時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)。結(jié)合二維碼等智能手段，為個(gè)性化智慧醫(yī)院[12]的建立提供新的檢測(cè)基礎(chǔ)。本文對(duì)芯片的3D打印方法具有通用性，對(duì)打印復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)的微流控芯片，均具有適用性。