細粒棘球蚴Eg HSP20蛋白基因的分子特征、表達及其反應原性研究

陳 英，喬 軍，孟慶玲*，鐘文強，劉田莉，貢莎莎，王熙鳳，黃運福，才學鵬

(1.石河子大學動物疾病防控兵團重點實驗室，新疆 石河子 832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】細粒棘球蚴病俗稱包蟲病，是由細粒棘球絳蟲的幼蟲——細粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus,Eg)寄生于哺乳動物臟器內(nèi)所引發(fā)的嚴重危害人體健康與畜牧業(yè)發(fā)展，呈全球性分布的一種人畜共患寄生蟲病。我國是受該病影響最為嚴重的國家之一，其中新疆是發(fā)病率最高的地區(qū)之一[1]。該病不僅嚴重影響著居民的健康生活，而且致使許多患者家庭因病返貧，對當?shù)氐纳鐣?jīng)濟發(fā)展造成了嚴重的影響。由于包蟲病具有發(fā)病緩慢、易傳播的特點，給該病的防控帶來了較大的困難[2-3]?！厩叭搜芯窟M展】研發(fā)有效的診斷試劑是該病防控的關(guān)鍵。目前，已被發(fā)現(xiàn)和鑒定的對于包蟲病的免疫診斷所用抗原主要是通過粗提囊液蛋白、原頭節(jié)而獲得的，雖然具有很高的敏感性，但和其它寄生蟲病患者血清存在嚴重的交叉反應，導致診斷的特異性不夠理想[4-5]。因此，篩選靈敏性強、特異性高的抗原顯得尤為重要。有研究發(fā)現(xiàn)，EgHSP20抗原基因可在六鉤蚴階段高效表達[2]，為弄清EgHSP20是否具有反應原性，【本研究切入點】本試驗對EgHSP20基因進行克隆，分析其重要的功能位點、結(jié)構(gòu)域以及抗原表位等分子特征，并在大腸桿菌中進行誘導表達，鑒定了重組蛋白EgHSP20的反應原性，【擬解決的關(guān)鍵問題】為深入研究EgHSP20重組蛋白在包蟲病診斷中的潛在價值奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株與試劑

表達載體pET-32a、菌株E.coliDH5α和E.coliBL21均由本實驗室保存；組織總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、T4 DNA 連接酶、PCR 反應試劑、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶EcoR I 和HindⅢ均購自TaKaRa公司。cECL Western Blot Kit與辣根酶標記的兔抗綿羊IgG購自北京康為世紀生物公司。蛋白純化試劑盒購自德國 Novagen 公司。綿羊細粒棘球蚴病陽性血清由中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.2 Eg HSP 20的引物設計

根據(jù)GenBank發(fā)表的EgHSP20基因序列，經(jīng)引物設計軟件Premier 5.0設計綿羊細粒棘球蚴EgHSP20基因抗原(APAU02000015.1)的特異性引物。上游引物為：GGAATTCATGTCGATTTTCCCTGTTC(斜體為保護性堿基，下劃線為EcoR I酶切位點)，下游引物為：CCCAAGCTTTCATTTAAAGAGAGGTGCC(斜體為保護性堿基，下劃線為HindⅢ酶切位點)；引物由(北京)華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 Eg HSP 20基因的RT-PCR擴增

將Eg囊液于離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，將沉淀(含有原頭蚴的樣本)根據(jù)組織總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用20 μl RT-PCR反應體系：H2O 9 μl，PCR Mixture 8 μl，cDNA模板2 μl，上下游引物各0.5 μl。EgHSP20基因PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 15 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min； 將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳，通過DNA 回收試劑盒對PCR產(chǎn)物純化回收。

1.4 目的基因的序列測定及分析

將純化回收后的EgHSP20目的基因片段和pMD19-T載體于4 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)菌液PCR篩選陽性克隆菌，提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切驗證后進行測序。將測序結(jié)果用MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan) 預測編碼蛋白的糖基化、磷酸化修飾位點；DNASTAR (Jameson Wolf方法)對其抗原表位進行預測。通過TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 進行結(jié)構(gòu)域預測。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽；對不同物種間的EgHSP20氨基酸序列進行同源性比對與分析。通過MEGA5.0軟件(Neighbor-joining Method)進行系統(tǒng)進化樹分析(bootstrap為1000)。

1.5 重組質(zhì)粒pET-Eg HSP20的構(gòu)建與鑒定

將測序正確的pMD-EgHSP20質(zhì)粒與原核表達載體pET-32a經(jīng)內(nèi)切酶EcoR I 和HindⅢ于37 ℃條件下分別進行雙酶切，并分別回收EgHSP20目的基因片段與載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶4 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，于氨芐抗性平板37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落，通過PCR和雙酶切方法篩選陽性克隆。

1.6 重組蛋白的誘導表達、純化及Western blot鑒定分析

將重組質(zhì)粒pET-EgHSP20轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細胞中，加入終濃度為1.0 mmol/L的誘導劑IPTG進行誘導表達。在誘導0、4、6、8 h后分別收集菌體和菌液，進行SDS-PAGE分析鑒定。用鎳柱親和層析法純化重組蛋白。將純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉(10 %)封閉2 h，加一抗(包蟲病綿羊陽性血清)室溫孵育 1～2 h，TBST buffer 洗滌 3～5 次，加入HRP 標記的兔抗綿羊 IgG，室溫孵育 2 h 后用TBST buffer 洗滌 3～5 次，加入顯色劑避光顯色1～2 min。經(jīng)Western blot鑒定，分析重組蛋白的反應原性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Eg HSP20基因的RT-PCR擴增

瓊脂糖凝膠電泳可檢測到約945 bp的目的條帶，與GenBank中公布的EgHSP20基因片段大小相符(圖1)。將目的條帶純化回收，克隆至pMD19-T載體內(nèi)，轉(zhuǎn)至(E.coliDH5α)感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定篩選陽性克隆菌。

2.2 Eg HSP20基因的序列測定及分析

經(jīng)測序，EgHSP20 cDNA開放閱讀框為945 bp，編碼314個氨基酸。同源性分析軟件比對發(fā)現(xiàn)，與GenBank中發(fā)表的EgHSP20基因序列同源性達99.05 %。在第66～71個堿基處由CCCCCC變?yōu)镚AGTTT。在第74個堿基處由C變?yōu)镚。在第269個堿基處由G變?yōu)锳。該蛋白含有1個N端糖基化位點，1個CAMP磷酸化位點，5個PKC磷酸化位點，10個CKⅡ磷酸化位點；抗原表位區(qū)集中在39～53、120～168位(圖2)。該蛋白無跨膜區(qū)域，無信號肽。EgHSP20和其它寄生蟲間氨基酸序列的比較及遺傳進化分析顯示，EgHSP20與牛帶絳蟲(TaeniasaginataHSP20，TaensagHSP20)位于同一遺傳分支，二者的親緣關(guān)系最近，同源性為86 %；而與肝片吸蟲、口膜殼絳蟲、華支睪吸蟲、日本血吸蟲、口膜殼絳蟲、曼氏裂體吸蟲及衛(wèi)氏并殖吸蟲的HSPs均低于40 %(圖3～4)。

M：DNA分子質(zhì)量標準； 1～2：RT-PCR擴增產(chǎn)物圖1 Eg HSP20基因RT-PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 Amplification of Eg HSP 20 gene by RT-PCR

2.3 Eg HSP 20基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

經(jīng)菌液PCR篩選鑒定陽性重組菌(圖5)。通過EcoR I /HindⅢ雙酶切驗證得到 945 bp的目的條帶和 5900 bp 的pET-32載體片段(圖6)，表明已成功構(gòu)建重組原核表達載體pET-EgHSP20。

2.4 重組蛋白Eg HSP 20在大腸桿菌中的誘導表達與純化

IPTG分別誘導0、4、6、8 h后， SDS-PAGE檢測分析結(jié)果顯示，重組蛋白EgHSP20相對分子質(zhì)量約為51 kDa，6 h時表達量最高?？扇苄苑治鲲@示，重組蛋白EgHSP20主要以包涵體形式存在。Western blot分析結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約51 kDa處出現(xiàn)特異性的單一反應條帶，顯示重組蛋白能和綿羊Eg陽性血清發(fā)生特異性的反應，表明重組蛋白EgHSP20具備良好的反應原性(圖7)。

引物序列(下劃線)；N端糖基化位點(虛線框)；CAMP磷酸化位點(雙下劃線)；PKC磷酸化位點(灰色陰影部分)；CKⅡ磷酸化位點(波浪線)；抗原表位集中區(qū)(方框)圖2 Eg HSP20 cDNA核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of Eg HSP20 cDNA

Eg HSP20:細粒棘球蚴；Fashe HSPs:肝片吸蟲；Hymic HSP20:口膜殼絳蟲；Clonorchis sinensis:華支睪吸蟲；Schi jap HSP 20:日本血吸蟲；Hym mic HSP20:口膜殼絳蟲；Schi man HSP20:曼氏裂體吸蟲；Parwes egg antigen:衛(wèi)氏并殖吸蟲；Taenia saginata HSP20:牛帶絳蟲圖3 不同寄生蟲HSP20蛋白氨基酸序列比較Fig.3 Comparison of amino acid of HSP20 protein among different parasites

Eg HSP20:細粒棘球蚴；Fashe HSPs:肝片吸蟲；Hymic HSP20:口膜殼絳蟲；Clonorchis sinensis: 華支睪吸蟲；Schi jap HSP 20:日本血吸蟲；Hym mic HSP20:口膜殼絳蟲；Schi man HSP20:曼氏裂體吸蟲；Parwes egg antigen:衛(wèi)氏并殖吸蟲；Taen sag HSP20:牛帶絳蟲圖4 幾種代表性寄生蟲HSP20蛋白基因系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of several representative worm based on HSP20 gene

3 討 論

目前已被發(fā)現(xiàn)與鑒定的Eg抗原主要包括囊液粗提抗原、原頭節(jié)、抗原5、Eg95、Eg10和EgAgB等[2-4]。Zhang等通過臨床實驗已證實囊液粗提抗原的敏感性為75 %～95 %，但其特異性比較差，存在一定缺陷，能和多房棘球絳蟲、豬帶絳蟲等其它絳蟲病、線蟲及吸蟲等存在交叉反應，影響實際診斷的準確性。而抗原5、Eg10和EgAgB等重組抗原特異性較高，但敏感性較低，給確診帶來困難[2]。因此，篩選具有強反應原性的細粒棘球蚴特異性抗原顯得尤為重要[6]。

M: DNA分子質(zhì)量標準; 1～4: 菌液PCR產(chǎn)物圖5 pET-Eg HSP20載體PCR鑒定Fig.5 Identification of pET-Eg HSP 20 by PCR

HSPs是生物體在不利于自身因素刺激下所產(chǎn)生一種可溶性的應激蛋白。正常狀態(tài)下在細胞內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能，應激時呈現(xiàn)高表達，有著應激保護作用[7-8]。且能作用于抗原提呈細胞而刺激細胞因子的分泌，參與免疫細胞的發(fā)育、分化與激活[9-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，許多寄生蟲的熱休克蛋白(HSPs)不僅參與蛋白的折疊、轉(zhuǎn)運、細胞的凋亡[13-15]、機體免疫等多種生理功能[16-18]，而且還具有較強的免疫原性，在基因疫苗中還可提高免疫效能的專一性，是當前研究熱點[19-21]。Snoeckx 等(2001)根據(jù)氨基酸序列結(jié)構(gòu)、生物功能與相對分子質(zhì)量的大小，將 HSPs分為小分子 HSP、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110等家族[10,14]。其中HSP70已被證實對血吸蟲、瘧原蟲、錐蟲等寄生蟲尤其是對棘球絳蟲具有重要診斷應用價值[12-13,17-18]。郭愛疆等(2004)從豬囊尾蚴蟲體中擴增出小熱休克蛋白，經(jīng)研究證實該蛋白能夠和豬囊蟲患畜血清發(fā)生特異性反應，具有良好的反應原性[16,22-23]。HSP20屬于小分子熱休克蛋白家族的一員，在六鉤蚴和原頭蚴階段表達量明顯超過了HSP70，在細粒棘球絳蟲蟲卵中發(fā)揮著重要作用[2]。

M：蛋白分子質(zhì)量標準；1：pET-32a菌經(jīng)IPTG誘導8h表達產(chǎn)物；2～5：pET-Eg HSP20菌經(jīng)IPTG誘導0 、4 、6 和8 h表達產(chǎn)物；6～7：pET-Eg HSP 20菌經(jīng)IPTG誘導8 h超聲破碎后上清和沉淀；8：純化的重組蛋白；9：Western blot分析圖7 目的蛋白Eg HSP 20 SDS-PAGE和Western blot分析Fig.7 Analysis of recombinant protein Eg HSP 20 by SDS-PAGE and Western blot

4 結(jié) 論

為尋找特異性高、敏感性強的包蟲病診斷抗原奠定基礎，本實驗篩選出了在細粒棘球蚴幼蟲階段熱休克蛋白家族中表達量較高，且至今尚未被深入研究的Eg-HSP20基因進行克隆，測序后對它重要的功能位點、結(jié)構(gòu)域、信號肽及抗原表位進行生物信息分析，成功構(gòu)建了pET-Eg-HSP20原核表達載體，實現(xiàn)了在E.coliBL21中高效表達。SDS-PAGE可檢測到約51 kDa蛋白大小的特異性條帶；Western blot鑒定顯示，Eg-HSP20重組蛋白能夠特異性的識別Eg陽性血清，證實此蛋白具有良好的反應原性，具有作為包蟲病診斷候選抗原分子的潛在價值。