奶牛源金黃色葡萄球菌臨床分離株的耐藥特性、生物膜及其相關(guān)基因分布研究

伍曄暉，孟慶玲，喬 軍 *，蔡擴(kuò)軍，王登峰，孟 丹，馬 帥，李重陽(yáng)，才學(xué)鵬

(1. 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 新疆 石河子 832003； 2. 烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆 烏魯木齊 830063；3. 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000；4. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎是奶牛最常見和最高發(fā)的疾病之一，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病原學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜病原種類多樣，其中金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是引起上述炎性疾病的主要病原菌之一[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，抗生素是治療奶牛SA感染的主要手段[2]。然而，由于畜牧業(yè)生產(chǎn)中抗菌藥物不合理的濫用現(xiàn)象，導(dǎo)致SA耐藥菌株逐年增多，致使抗生素療法的治愈率降低[3]。與此同時(shí)，由于抗生素在乳中的殘留，致使鮮奶受到一定程度的耐藥菌株和抗生素污染，導(dǎo)致牛奶的品質(zhì)下降，并且耐藥菌株和耐藥基因可通過(guò)奶制品傳播給人群，給人們的身體健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅[4]。作為最重要的人獸共患食源性細(xì)菌之一，近年來(lái)隨著抗菌藥物的濫用SA耐藥菌株不斷增多，尤其是耐甲氧西林SA(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的大量出現(xiàn)，給奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎的防治帶來(lái)了更大的困難[5]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】研究發(fā)現(xiàn)，SA生物膜的形成能力與SA菌株毒力和耐藥性密切相關(guān)，許多MRSA流行株不僅具有多重耐藥性，還具有形成生物膜的能力，致使細(xì)菌的毒力進(jìn)一步增強(qiáng)[6-7]。黏附素具有使MRSA黏附到宿主靶細(xì)胞的作用，其黏附能力對(duì)MRSA的感染及生物膜的形成起著重要作用[8]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】新疆是我國(guó)重要的奶源地之一，牛奶產(chǎn)量位居西部地區(qū)前列。為了了解新疆地區(qū)MRSA流行株的耐藥情況和生物膜的形成能力及其相關(guān)基因的分布情況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)奶牛源MRSA新疆流行株的耐藥表型和生物膜及其相關(guān)基因進(jìn)行了檢測(cè)研究，為MRSA分子流行病學(xué)調(diào)查和臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Baird-Parker培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌 (E.coli) DH5α菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、pMD19-T載體、DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；生化化鑒定管購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；抗菌藥物紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；結(jié)晶紫購(gòu)自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；96孔微孔板購(gòu)自上海市蔚宏生物科技有限公司。

1.2 奶牛乳樣品的采集

在2015年1月至2017年5月期間，從新疆五家渠、石河子、沙灣、瑪納斯、阿克蘇5個(gè)地區(qū)的規(guī)模化奶牛場(chǎng)分別采集臨床型乳房炎牛乳及子宮內(nèi)膜炎膿液樣品386份，通過(guò)溫水清洗乳房、肛門及外陰部，并使用75 %酒精棉球?qū)ζ溥M(jìn)行消毒處理，收集第3把奶后的奶樣及子宮內(nèi)容物分別放于滅菌的試劑管中，置于冰盒內(nèi)，運(yùn)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.3 SA分離鑒定

將采集的樣品接種于Baird-Parker培養(yǎng)基，放于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12～48 h。挑取具有典型特征的單菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。對(duì)純化菌進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，然后隨機(jī)選取分離株用SA生化鑒定管測(cè)定其生化反應(yīng)特性；根據(jù)GenBank中已公布的SA 16S rRNA的序列設(shè)計(jì)通用引物，對(duì)SA分離株進(jìn)行16SrRNA序列比對(duì)分析。將分離鑒定的SA在BHI肉湯中37 ℃培養(yǎng)24 h，再將500 μl 所得新鮮菌液加入到500 μl 40 %甘油中震蕩混合均勻制成20 %甘油菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SA分離株藥敏試驗(yàn)及MRSA鑒定

用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，接種于BHI培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)20～24 h，再用滅菌生理鹽水將細(xì)菌濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，?00 μl菌液，均勻涂布于MHA培養(yǎng)基，涂布均勻后貼上15種藥敏紙片，用鑷子輕壓紙片使其與培養(yǎng)基表面緊密接觸。放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后測(cè)量抑菌圈直徑。通過(guò)藥敏試驗(yàn)，初步判定30 μg頭孢西丁抑菌環(huán)直徑≤21 mm的菌株為MRSA；采用PCR方法(檢測(cè)MecA基因)進(jìn)一步篩選和鑒定MRSA流行株，引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[9]。

1.5 MRSA和MSSA菌株基因組DNA的提取

抽取MRSA和MRSA流行株接種至無(wú)菌BHI培養(yǎng)液于37 ℃振蕩過(guò)夜，取1.5 mL細(xì)菌培養(yǎng)液于無(wú)菌EP管內(nèi)，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，余下操作嚴(yán)格按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。DNA產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 MRSA和MSSA生物膜的檢測(cè)

采用改良微量孔板法檢測(cè)SA不同分離株生物膜形成能力。用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，接種于TSB培養(yǎng)基中，振蕩過(guò)夜。將活化的菌液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接于TSB肉湯中繼續(xù)培養(yǎng)，使其OD600mm達(dá)到0.2左右，分別吸取菌液200 μl加入到96孔微孔板中，每株分別移入8個(gè)平行孔中，靜置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；然后用微量移液器吸去孔中的培養(yǎng)基，加入200 μl無(wú)菌蒸餾水洗滌微孔板重復(fù)3次，置于室溫條件下干燥45 min，然后向每個(gè)孔中加入150 μl濃度為1 %的結(jié)晶紫溶液在室溫條件下染色30 min，棄去染色液，再加入200 μl無(wú)菌蒸餾水洗滌微孔板4次，在空氣中干燥30 min；再向每個(gè)孔中加入150 μl濃度為95 %的乙醇溶液脫色30 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD570nm；將脫色后的微孔板直接放在倒置顯微鏡下觀察生物膜的形態(tài)，拍照記錄。

1.7 MRSA和MSSA生物膜形成相關(guān)基因的檢測(cè)

2 結(jié)果與分析

2.1 SA分離鑒定

從新疆5個(gè)地區(qū)采集到386份臨床型乳房炎牛乳及子宮內(nèi)膜炎膿液樣品中共分離出164株SA。SA在Baird-Parker培養(yǎng)基上長(zhǎng)出灰或黑色菌落，菌落周圍有一渾濁帶，挑取的單菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢后可見像葡萄樣串狀紫色球菌(圖1)。生化鑒定結(jié)果顯示，SA能發(fā)酵蔗糖、乳糖、蕈糖、果糖、甘露糖、麥芽糖，缺氧環(huán)境中產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，尿素、精氨酸水解，乙酰葡糖胺、硝酸鹽還原反應(yīng)陽(yáng)性，VP反應(yīng)弱陽(yáng)性，木糖、木醇、蜜二糖、山梨醇反應(yīng)陰性。

2.2 16SrRNA序列比對(duì)分析

對(duì)分離株SA-xj45、SA-xj46、SA-xj47、SA-xj64、SA-xj65、SA-xj66、SA-xj75與SA標(biāo)準(zhǔn)株S.aureusECNU-UA1，大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株E.coliATCC35469、E.coli51Sh，鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株S.Oligoferm-entansAS1.3089、S.australisChDCB189，綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株P(guān).aeruginosaNAPCC-1、P.aeruginosaATCC 19660，腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株S.entericaATCC9150、S.entericaLGS4進(jìn)行16SrRNA序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示分離株與SAS.aureusECNU-UA1親緣性最近，同源性達(dá)96 %，與大腸桿菌、鏈球菌、綠膿桿菌、腸炎沙門氏菌親緣性相對(duì)較遠(yuǎn)(圖2)。

A：SA在Baird-Parker培養(yǎng)基的菌落形態(tài)；B：革蘭氏染色鏡檢SA菌體圖1 SA分離株菌落及鏡檢形態(tài)Fig.1 Colony morphology of SA in Baird-Parker and gram staining

圖2 16SrRNA序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Results of sequence alignment of 16SrRNA

7.苯唑西林8.青霉素9.紅霉素10.頭孢西丁11.四環(huán)素12.利福平7.Oxacillin; 8.Penicillin; 9.Erythromycin; 10.Cefoxitin; 11.Tetracycline 12. Rifampicin圖3 MRSA(A)和MSSA(B)藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Assay of drug susceptibility of MRSA(A) and MSSA(B) isolates

圖4 MRSA與MSSA對(duì)抗菌藥物的耐藥率Fig.4 Drug resistance rates of MRSA and MSSA isolates

2.3 MRSA檢出率及藥敏試驗(yàn)

164株SA中檢出22株MRSA，MRSA檢出率為13.41 %，其余均為MSSA流行株。MRSA對(duì)抗菌藥物的耐藥表型明顯多于MSSA(圖3)；MRSA對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率也明顯高于MSSA(圖4)。

2.4 MRSA生物膜生成能力測(cè)定

通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定OD570nm，結(jié)果顯示，在24 h時(shí)MRSA和MSSA生物膜生成能力差異顯著(P<0.05)，MRSA菌株的生物膜生成能力顯著高于MSSA菌株(圖5～6)。通過(guò)倒置顯微鏡觀察在24 h時(shí)，MRSA和MSSA菌株都生成了典型的生物膜形態(tài)，MRSA菌株生物膜厚度顯著高于MSSA菌株(圖6)。

2.5 MRSA和MSSA生物膜形成相關(guān)基因的檢測(cè)

生物膜形成相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果顯示，MRSA菌株clfA 、clfB、fnbA、fnbB、Fib、cna、FnBP基因檢出率分別為100 %(n=22)、95.45 %(n=21)、40.91 %(n=9)、90.91 %(n=20)、86.36(n=19)、54.55

%(n=12)、54.55 %(n=12)；除基因fnbA，其余檢出率均高于MSSA菌株(圖7～8)。

3 討 論

大量耐藥性菌株的出現(xiàn)已經(jīng)成為SA性奶牛乳房炎防控的瓶頸[11]。藥物敏感性監(jiān)測(cè)不僅可以反映SA的耐藥現(xiàn)狀，同時(shí)也為此病的治療提供用藥依據(jù)。本研究中，在奶牛臨床乳房炎樣品中MRSA的檢出率達(dá)13.41 %，所有MRSA菌株均耐青霉素和頭孢西丁。與MSSA相比，MRSA菌株對(duì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶、左氧氟沙星的耐藥率明顯增高，同時(shí)還出現(xiàn)了對(duì)環(huán)丙沙星、氯霉素、慶大霉素的耐藥菌株，且同一株菌出現(xiàn)耐多種抗生素的情況，提示SA流行株耐藥性十分嚴(yán)峻。本研究結(jié)果顯示，MRSA菌株對(duì)利福平的耐藥率有所升高，可能由于自發(fā)性突變和在生產(chǎn)中經(jīng)常使用氟喹諾酮類藥物的共同作用[12]。MRSA菌株對(duì)呋喃妥因、替考拉寧、磷霉素的耐藥率低于19 %，這可能與臨床較少使用有關(guān)，可作為治療SA感染引起的奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎的優(yōu)選藥，特別適用于治療MRSA和β-內(nèi)酰胺類耐藥株的嚴(yán)重感染。

圖5 MRSA與MSSA分離株生物膜檢測(cè)結(jié)果(OD570nm)Fig.5 Biofilm determination of MRSA and MSSA isolates (OD570nm)

A與B：倒置顯微鏡下呈現(xiàn)的生物膜形態(tài)(400)；C與D：96孔微孔板中乙醇脫色后小孔A and B: The biofilm morphology under inverted microscope(400 );C and D: 96-well polystyrene microtiter plates after decolorization of ethanol圖6 MRSA與MSSA分離株形成的生物膜Fig.6 Formation of biofilm by MRSA (A/C) and MSSA(B/D) isolates

M.DNA標(biāo)志物(DL-2000); 1.陰性對(duì)照; 2. clfA基因(104 bp); 3. clfB基因(194 bp); 4. fnbA:基因(133 bp); 5. fnbB(197 bp); 6. Fib基因(239 bp); 7. cna基因(156 bp); 8. FnBP基因(1500 bp)M.DNA marker 2000; 1. Negative control; 2. clfA gene; 3. clfB gene; 4. nbA gene; 5. fnbB gene; 6. Fib gene; 7. cna gene; 8. FnBP gene圖7 MRSA菌株檢測(cè)黏附素電泳結(jié)果Fig.7 Electrophoresis result of adhesin in MRSA isolates

圖8 MRSA與MSSA菌株生物膜相關(guān)基因陽(yáng)性分布Fig.8 Positive distribution of biofilm related genes in MRSA and MSSA isolates

研究表明，細(xì)菌生物膜(bacterial biofilm，BBF)可以通過(guò)形成特殊結(jié)構(gòu)以逃避宿主免疫系統(tǒng)對(duì)其的清除作用，還可通過(guò)抗生素滲透限制、營(yíng)養(yǎng)限制和形成特殊表型來(lái)抵抗抗生素，因此，BBF的形成是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的主要因素，也是動(dòng)物和人類發(fā)生持續(xù)性感染的重要因素[13-15]。本研究結(jié)果顯示，MRSA菌株的生物膜生成能力均顯著高于MSSA菌株(P<0.05)，且MRSA菌株比MSSA菌株表現(xiàn)出多重耐藥和較強(qiáng)的抗性。由此可知，SA菌株的生物膜生成能力與其耐藥性密切相關(guān)。

在BBF形成過(guò)程中，細(xì)菌的群體感應(yīng)(QS)系統(tǒng)可通過(guò)合成和分泌自誘導(dǎo)分子(AI)的濃度來(lái)控制整個(gè)細(xì)菌群體，當(dāng)AI濃度隨著細(xì)菌群體密度達(dá)到一定閾值時(shí)，即可啟動(dòng)特異性基因的表達(dá)，使細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境刺激做出反應(yīng)，以增強(qiáng)細(xì)菌群體的生命力，導(dǎo)致細(xì)菌侵襲力和致病性明顯增強(qiáng)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，超過(guò)90 %的MRSA菌株攜帶凝聚因子A(clfA)和B(clfB)、纖連蛋白結(jié)合蛋白B(fnbB)；大多數(shù)MRSA菌株攜帶纖維蛋白原結(jié)合蛋白(Fib)、膠原結(jié)合蛋白(cna)。有研究指出，fnbA、fnbB介導(dǎo)的生物膜形成是MRSA生物膜形成的主要途徑；clfA基因在乳酸乳球菌中表達(dá)后，使得菌株毒力增強(qiáng)[18-19]。由本研究結(jié)果可知，在MRSA菌株中，fnbB 的檢出率遠(yuǎn)高于fnbA，且clfA的檢出率高達(dá)100 %，由此推測(cè)clfA、fnbB在MRSA生物膜的形成中具有更為重要的作用。國(guó)外學(xué)者Szezuka等[20]收集了80株臨床MRSA菌株進(jìn)行生物膜相關(guān)基因檢測(cè)，結(jié)果超過(guò)50 %的菌株攜帶fnbB基因，但未檢測(cè)出fnbA基因，這與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致。此外，SA表面黏附素在生物膜生產(chǎn)中同樣起著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，MRSA菌株clfA 、clfB、fnbB、Fib、cna、FnBP基因檢出率均高于MSSA菌株，提示這與MRSA菌株較強(qiáng)的生物膜生成能力及其較強(qiáng)抗性具有相關(guān)性。由于不同的生物膜相關(guān)基因的表達(dá)水平可能存在差異[21]，因此有必要對(duì)生物膜形成相關(guān)基因在MRSA菌株中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。MRSA較強(qiáng)的生物膜生成能力、黏附素的高攜帶率與MRSA毒力之間的相關(guān)性尚需進(jìn)一步開展動(dòng)物試驗(yàn)研究。

4 結(jié) 論

在臨床用藥時(shí)，可將呋喃妥因、替考拉寧、磷霉素作為優(yōu)選藥用于治療SA引發(fā)的奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎及MRSA和β-內(nèi)酰胺類耐藥株引起的嚴(yán)重感染。MRSA菌株比MSSA菌株具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，clfA 、clfB、fnbB、Fib、cna、FnBP基因在其中發(fā)揮著重要作用。MRSA菌株較強(qiáng)的生物膜形成能力及其較強(qiáng)抗性之間具有相關(guān)性。