利用SCoT檢測(cè)菜心F2分離群體的遺傳多樣性

羅海玲，史衛(wèi)東*，康紅衛(wèi)，張 力，熊發(fā)前，農(nóng)貴雄

(1. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西 南寧 530007；2. 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；3. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】菜心(BrassicaCampestrisL.ssp.chinensisVar.utilisTsen et Le)是兩廣著名特產(chǎn)蔬菜，種植和生產(chǎn)區(qū)域主要為華南地區(qū)，現(xiàn)已引種到寧夏、甘肅、河南、云南及江西等省(自治區(qū))，種植面積逐漸加大。菜心品種繁多，但仍然以常規(guī)種為主。菜心遺傳多樣性水平較低，親緣關(guān)系較近[1]，常用育種方法是系統(tǒng)選育和雜交法，僅利用表型鑒定篩選具有周期長(zhǎng)和效率低等問(wèn)題。F2分離群體后代是雜交育種的常用材料，開(kāi)展菜心F2群體后代的遺傳多樣性分析，可以彌補(bǔ)表型鑒定的不足，提高篩選和鑒定效率；快速鑒定F2∶3家系間的優(yōu)異單株，對(duì)高抗優(yōu)質(zhì)菜心品種選育效率的提高也同樣具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】利用ISSR標(biāo)記檢測(cè)表明菜心品種的遺傳背景狹窄[4]，利用RAPD標(biāo)記可以檢測(cè)出菜心品種間不同程度的遺傳差異，并根據(jù)遺傳距離和相似系數(shù)確定品種間的親緣關(guān)系[2-3]，利用AFLP和SCoT標(biāo)記檢測(cè)表明菜心遺傳多樣性程度較低，遺傳變異主要來(lái)源于種內(nèi)[5-10]。SCoT標(biāo)記的多態(tài)性來(lái)源于植物基因翻譯起始序列ATG及其側(cè)翼序列[11]，偏向候選功能基因區(qū)，容易與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)[11-12]，結(jié)合了ISSR標(biāo)記和 RAPD標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，在植物遺傳多樣性研究中廣泛應(yīng)用[13-14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人利用分子標(biāo)記在作物親緣關(guān)系鑒定中進(jìn)行了大量研究，但利用SCoT標(biāo)記檢測(cè)菜心F2分離群體遺傳多樣性方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以菜心抗小菜蛾品種Caixin65和感小菜蛾品種Caixin69及其雜交后代所得的54份F2分離群體家系為實(shí)驗(yàn)材料，利用SCoT標(biāo)記檢測(cè)遺傳多樣性，為高抗優(yōu)質(zhì)菜心新品種的選育和分子標(biāo)記輔助育種提供理論基礎(chǔ)和基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所菜心抗小菜蛾品種Caixin65和感小菜蛾品種Caixin69的雜交F2分離群體得到的54份F2∶3家系及2個(gè)親本為實(shí)驗(yàn)材料，按家系種植，常規(guī)田間管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采用改良的CTAB法提取基因組總DNA[15]。

1.2.2 SCoT分析 優(yōu)化后的PCR體系20.0 μl：1.5 mmol/L MgCl2、0.5 μmol/L引物、0.5 mmol/L dNTPs、1.25 UTaqDNA聚合酶、50 ng基因組DNA。PCR程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖膠電泳(1×TAE buffer)和溴化乙錠染色后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存。17條引物序列如下：

S1：CAACAATGGCTACCACCA；S2：CAACAATGGCTACCACCC；

S4：CAACAATGGCTACCACCT；S5：CAACAATGGCTACCACGA；

S6：CAACAATGGCTACCACGC；S11：AAGCAATGGCTACCACCA；

S13：ACGACATGGCGACCATCG；S14：ACGACATGGCGACCACGC；

S18：ACCATGGCTACCACCGCC；S19：ACCATGGCTACCACCGGC；

S20：ACCATGGCTACCACCGCG；S22：AACCATGGCTACCACCAC；

S29：CCATGGCTACCACCGGCC；S30：CCATGGCTACCACCGGCG；

S31：CCATGGCTACCACCGCCT；S33：CCATGGCTACCACCGCAG；

S34：ACCATGGCTACCACCGCA。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

將瓊脂糖凝膠板的每一條SCoT擴(kuò)增產(chǎn)物視為1 個(gè)位點(diǎn)，有帶記為1，無(wú)帶記為0，建立各個(gè)SCoT 引物在各個(gè)樣品種的擴(kuò)增分布表，利用GenAlEx 6.0軟件計(jì)算遺傳多樣性分析，并用不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(unweightpair-group method using arithmetic averages, UPGMA) 進(jìn)行聚類分析。將F2∶3家系的抗蟲(chóng)分級(jí)默認(rèn)為與菜心F2群體的相同[15]，并作為表型性狀與SCoT標(biāo)記得到的Nei遺傳距離矩陣做mantel測(cè)試，以檢驗(yàn)抗蟲(chóng)表型與分子標(biāo)記多態(tài)性的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 56份菜心的SCoT多態(tài)性

由表1可知，17對(duì)引物共擴(kuò)增出條帶161條，其中多態(tài)性條帶共61條，多態(tài)性百分率為38.80 %；平均每條引物擴(kuò)增出條帶9條，其中多態(tài)性條帶4條。片段大小為500～1500 bp。結(jié)果表明，每條引物能夠鑒定出54份材料的遺傳差異，但引物檢測(cè)效率相差很大，多態(tài)性豐富的引物檢測(cè)的遺傳多樣性也豐富(圖1)。

2.2 56份菜心的遺傳多樣性

由表2可知，56份菜心的遺傳多樣性指數(shù)變化范圍均發(fā)生于母本69與Pop21家系之間，多態(tài)性位點(diǎn)百分率變幅為24.24 %～66.67 %，平均值為45.02 %，觀察等位基因數(shù)(Na)變幅為0.6212～1.4697，平均值為1.1613；有效等位基因數(shù)(Ne)變幅為1.1714～1.4714，平均值為1.3184；Shannon多樣性指數(shù)(I)變幅為0.0147～0.4031，平均值為0.2723；期望雜合度(He)變幅為0.1004～0.2761，平均值為0.1865。Nei遺傳距離平均值為0.225，最大值0.586(Pop26～Pop59)，最小值0.001(Pop9～Pop14)，表明多數(shù)家系的分子遺傳距離相近，家系間的遺傳多樣性較低，但少數(shù)家系之間已經(jīng)發(fā)生了遺傳多樣性變化。

表1 17條ScoT引物擴(kuò)增結(jié)果

在Nei遺傳距離0.080之處，可以將56份菜心分為5類。第1類包括40個(gè)家系，分別是Pop3～Pop4、Pop6～Pop9、Pop11～Pop14、Pop16～Pop17、Pop23～Pop29、Pop31、Pop33～Pop35、Pop37～Pop38和Pop40～Pop54。第2類包括8個(gè)家系，分別是Pop1、Pop2、Pop10、Pop19、Pop20、Pop21、Pop32和Pop39。第3類包括4個(gè)家系和2個(gè)親本，分別是母本69、父本65、Pop5、Pop15、Pop22和Pop30。第4類包括1個(gè)家系，即Pop36。第5類包括1個(gè)家系，即Pop18。第1類的40個(gè)家系表明SCoT標(biāo)記未檢測(cè)出多數(shù)家系間的顯著基因組變化，可能是由于大部分家系之間尚未發(fā)生顯著分離；而第2、3、4和5類的家系可能發(fā)生了基因組變化，因而呈現(xiàn)出SCoT多態(tài)性。聚類分析結(jié)果(圖2)也表明少數(shù)家系可以繼續(xù)用于優(yōu)異家系選育。

2.3 菜心遺傳多樣性的抗蟲(chóng)性評(píng)價(jià)

除SCoT多態(tài)性外，抗蟲(chóng)性也是評(píng)價(jià)此群體的重要指標(biāo)。利用SCoT分子標(biāo)記得到的Nei遺傳距離與F2∶3家系的抗蟲(chóng)系數(shù)進(jìn)行mantel測(cè)試，結(jié)果表明兩者相關(guān)不顯著(圖3)，R2=-0.007(P=0.6)，這說(shuō)明家系的抗蟲(chóng)性基因已發(fā)生重組，表型性狀有所改變，SCoT分子標(biāo)記未能反映F2∶3家系的抗蟲(chóng)性差異，其抗蟲(chóng)性水平可能需要在高世代繼續(xù)鑒定，才能選擇出優(yōu)異的家系。

M：DL2000 DNA 標(biāo)記；1～56：56份菜心樣本 M: DL2000 DNA marker; 1-56: 56 Chinese flowering cabbage samples圖1 ScoT 20引物對(duì)56份菜心基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The SCoT amplification profile of 56 Chinese flowering cabbage samples with primer SCoT 20

表2 56份菜心的SCoT遺傳多樣性信息

續(xù)表2 Continued table 2

編號(hào)Number多態(tài)性位點(diǎn)百分率(%)Percentage of polymorphic loci觀察等位基因數(shù)(Na)Observed number of alleles有效等位基因數(shù)(Ne)Effective number of allelesShannon多樣性指數(shù)(I)Shannon's information index期望雜合度(He)Expected heterozygosity Pop4653.031.2424 1.3750 0.3207 0.2197 Pop4740.911.1667 1.2893 0.2474 0.1695 Pop4836.360.8485 1.2571 0.2199 0.1506 Pop4943.941.2121 1.3107 0.2657 0.1820 Pop5037.881.1515 1.2678 0.2291 0.1569 Pop5139.391.1212 1.2786 0.2382 0.1632 Pop5242.421.1818 1.3000 0.2565 0.1757 Pop5339.391.1061 1.2786 0.2382 0.1632 Pop5443.941.1515 1.3107 0.2657 0.1820 均值A(chǔ)verage45.021.1613 1.3184 0.2723 0.1865

圖2 56份菜心的UPGMA聚類分析結(jié)果Fig.2 Dendrogram for 56 Chinese flowering cabbage samples based on UPGMA analysis

圖3 56份菜心遺傳多樣性與抗蟲(chóng)相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of 56 Chinese flowering cabbage samples between genetic diversity and insect-resistance

3 討 論

SCoT標(biāo)記目前廣泛應(yīng)用于菜心[10]、水稻[11]、芒果[13, 16]、馬鈴薯[14]、葡萄[17]、蘭[18]、柿[19-20]、芥藍(lán)[21]、枇杷[22]及煙草[23]等數(shù)10種作物的遺傳多樣性分析與親緣關(guān)系的鑒定，結(jié)果表明：SCoT 分子標(biāo)記在芒果遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究中是一種非常有效的分子標(biāo)記[12]，不僅適用于不同品種的葡萄、不同生態(tài)地理分布的芒果及不同倍性的枇杷等果樹(shù)的遺傳多樣性等的研究，也適用于芥藍(lán)、菜心等蔬菜親緣關(guān)系的鑒定，這表明SCoT標(biāo)記在種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的鑒定方面是一種高效可信的技術(shù)。

研究也表明SCoT引物不適于對(duì)普通煙草種內(nèi)不同類型的遺傳分析，可用于煙草種間的遺傳關(guān)系的分析及遠(yuǎn)緣雜種的鑒定[23]。本研究選用17對(duì)SCoT引物從56份菜心F2分離群體中共擴(kuò)增出161個(gè)條帶，多態(tài)性百分率為38.8 %，與史衛(wèi)東等[10]報(bào)道的33份菜心SCoT的平均多態(tài)性相當(dāng)，低于王麗[2]、譚雪等[3]和張金艷等[24]的RAPD檢測(cè)結(jié)果，也低于具有部分相同菜心品種的AFLP檢測(cè)結(jié)果[9]。本研究中，SCoT多態(tài)性條帶共61條，平均每條引物擴(kuò)增出條帶9條，其中多態(tài)性條帶平均為4條，低于Shi等[9]的AFLP多態(tài)性研究結(jié)果。這表明菜心家系間的SCoT多態(tài)性變化范圍較大，所以引物檢測(cè)效率仍然是提高SCoT標(biāo)記檢測(cè)效率的關(guān)鍵，SCoT標(biāo)記是單引物標(biāo)記，多態(tài)性高的引物檢測(cè)的遺傳多樣性水平也較高[10]。本研究結(jié)果表明，除了能夠用于菜心品種不同生態(tài)型的遺傳多樣性分析[10]，SCoT標(biāo)記也可以初步用于大量家系間的批量檢測(cè)，從而擴(kuò)大了其在育種中的應(yīng)用范圍。

F2群體是雜交育種常用的臨時(shí)性分離群體，重復(fù)性差，隨機(jī)偏差大，性狀聚合時(shí)間較長(zhǎng)且容易丟失[25]。本研究以抗/感蟲(chóng)品種雜交后代得到的F2∶3家系及其親本為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行SCoT聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)家系歸為一類，意味著這些家系間還未發(fā)生顯著的基因組變化，但少數(shù)家系發(fā)生了基因組變化。SCoTNei遺傳距離與F2∶3家系抗蟲(chóng)系數(shù)的mantel測(cè)試表明兩者相關(guān)不顯著，但從株高、開(kāi)展度、葉片數(shù)、主薹高度和主苔粗度等性狀表現(xiàn)來(lái)看，SCoT聚類結(jié)果較明顯：株高和主薹高度均顯著增大，其中株高從31.2 cm升高至45.4 cm，主薹高度從30.0 cm升高至44.8 cm，主薹直徑逐漸變大(從1.3 cm增至1.8 cm)，葉片數(shù)增多(從19.3片增至28.4 片)，抗蟲(chóng)指數(shù)升高(從0.5255升高至0.71)；但每一類又稍有不同：第2類的抗蟲(chóng)指數(shù)最低(0.5255)，第3類的葉片數(shù)和主薹直徑變化與第1類接近，都比較低，第5類的其他性狀值都較高但開(kāi)展度較低。這意味著F2∶3家系可能在基因組水平上確實(shí)發(fā)生了不同程度的分離和重組，包括ATG 翻譯起始位點(diǎn)及其側(cè)翼區(qū)域編碼序列的染色體重組，或者包含抗蟲(chóng)相關(guān)基因片段的染色體重組，通過(guò)不同性狀的基因組位點(diǎn)變化，呈現(xiàn)跟蹤性狀的SCoT多態(tài)性和抗蟲(chóng)相關(guān)性狀的變異。因此，利用SCoT標(biāo)記檢測(cè)F2分離群體的遺傳多樣性水平，結(jié)合表型及抗性篩選，可以加快純化育種進(jìn)程，獲得廣泛分離的育種資源，提高育種效率。SCoT標(biāo)記能跟蹤性狀并與檢測(cè)分離群體的遺傳多樣性水平在花生異源多倍化過(guò)程中也得到證明，花生SCoT 產(chǎn)物在 F1基因組即開(kāi)始發(fā)生變化，在分離后代中丟失的親本條帶以父本條帶為主[26]。

本研究中2個(gè)親本(65和69)歸為一類的原因可能與種質(zhì)資源狹窄有關(guān)[9]，菜心起源和生產(chǎn)區(qū)域主要在華南地區(qū)，品種交流頻繁，因而造成親緣關(guān)系較近，親本歸為一類，而且抗蟲(chóng)性是數(shù)量性狀，抗/感蟲(chóng)品種雜交獲得的F2群體和高世代的抗性水平較高但較不穩(wěn)定[27]，在白菜抗蟲(chóng)育種利用F2群體并進(jìn)行早世代選擇可以提高育種效率[28-29]。前期研究結(jié)果表明菜心抗蟲(chóng)親本、感蟲(chóng)親本及F2代分離群體后代出現(xiàn)了明顯的分離，菜心對(duì)小菜蛾的抗蟲(chóng)性可能是由顯性單基因控制的，12個(gè)抗蟲(chóng)EST-SSR標(biāo)記中的7個(gè)標(biāo)記卡方測(cè)驗(yàn)顯著，意味著可能與抗蟲(chóng)性有關(guān)[15]。本研究利用54份F2∶3家系及2個(gè)親本進(jìn)行SCoT分析發(fā)現(xiàn)僅有少數(shù)家系發(fā)生了基因組變化，雖然SCoT多態(tài)性與抗蟲(chóng)性相關(guān)不顯著，但從綜合性狀來(lái)看SCoT能夠檢測(cè)出家系和性狀間的遺傳多樣性，因此結(jié)合表型及抗性篩選，可以加快純化進(jìn)程，獲得廣泛分離的育種資源，提高育種效率。

4 結(jié) 論

SCoT標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、多態(tài)性較豐富等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)SCoT檢測(cè)表明大部分菜心家系間遺傳距離接近，但少數(shù)家系間已經(jīng)發(fā)生了分離，將ScoT標(biāo)記用于菜心家系的遺傳多樣性檢測(cè)，結(jié)合表型篩選將有助于品種選育效率的提高。