利用SSR技術(shù)鑒定玉米雜交種家佳榮2號(hào)”的種子純度

李 陽(yáng)，范夢(mèng)偉，季曉坤，賈相初,3，吳 彬，趙自仙*，王德海

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南盛衍種業(yè)有限公司，云南 玉溪 653100；3.鎮(zhèn)雄縣種子管理站，云南 鎮(zhèn)雄 657200；4.開遠(yuǎn)市植檢植保站，云南 開遠(yuǎn) 661699；5.云南省種子管理站，云南 昆明 650031)

玉米是雜種優(yōu)勢(shì)利用最成功的作物之一?！狙芯恳饬x】高純度的玉米雜交種子是充分發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)，雜交種子的純度直接影響農(nóng)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和農(nóng)戶的收成。種子純度是評(píng)定種子質(zhì)量等級(jí)的主要指標(biāo)之一，玉米雜交種子純度鑒定是玉米種子質(zhì)量控制體系中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定法依賴于品種表型差異，受環(huán)境影響較大、工作量大、鑒定周期長(zhǎng)、成本高、易受季節(jié)限制，影響種子質(zhì)量檢測(cè)、監(jiān)督的速度和質(zhì)量[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】純度鑒定的方法也很多，同工酶和種子貯藏蛋白等生理生化標(biāo)記存在著多態(tài)性不夠豐富、組織和器官特異性差、穩(wěn)定性差等問(wèn)題，也限制了在玉米雜交種純度鑒定中的應(yīng)用。其中，蛋白鑒定因種子貯藏蛋白質(zhì)為基因表達(dá)產(chǎn)物，種類有限、多態(tài)性差，且結(jié)果表達(dá)并非完全互補(bǔ)，所以，該技術(shù)不能應(yīng)用于所有玉米單交種的純度鑒定[2]。例如‘農(nóng)大108’用了近2年時(shí)間才找到特異性蛋白譜帶，‘豫玉27’也存在同樣情形，這給品種純度鑒定帶來(lái)很大問(wèn)題[3]。田間小區(qū)種植鑒定是在幼苗至成熟期間，根據(jù)不同品種的特征特性鑒別出異型植株的方法。該方法的鑒定依據(jù)是植株的形態(tài)特征和生育特性的差異。這些性狀主要是指株高、株形、葉形和葉色、花形和花色、穗形和穗色、芒的有無(wú)、長(zhǎng)短和顏色、粒形和粒色、抗病性和生長(zhǎng)特性等。適用于貿(mào)易、調(diào)種的仲裁檢驗(yàn)，也是經(jīng)濟(jì)糾紛的依據(jù)。田間小區(qū)植株鑒定是被認(rèn)可的品種鑒定的可靠方法，但田間小區(qū)種植鑒定要在玉米整個(gè)生育期進(jìn)行，鑒定周期長(zhǎng)，此外還受鑒定人員的專業(yè)水平、環(huán)境等的影響，從而影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，玉米種子純度的檢驗(yàn)方法已從蛋白鑒定逐漸向分子標(biāo)記鑒定發(fā)展[4]，對(duì)于玉米雜交種的純度和真實(shí)性鑒定，SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)越性，SSR標(biāo)記具有共顯性、重復(fù)性好、多態(tài)性高、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、檢測(cè)手段簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)[5]，在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)發(fā)展中起著巨大的推動(dòng)作用。由于SSR標(biāo)記完全符合作物品種鑒定的4個(gè)基因準(zhǔn)則：即環(huán)境的穩(wěn)定性、品種間變異的可識(shí)別性、最小品種內(nèi)變異和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，因此可準(zhǔn)確地檢測(cè)生物體中的遺傳變異[6]。SSR標(biāo)記廣泛、隨機(jī)、均勻地分布于作物基因組，而且與RFLP或RAPD標(biāo)記相比，SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有數(shù)量豐富、多態(tài)性好、遺傳上呈共顯性、擴(kuò)增穩(wěn)定、引物序列易于交流等特點(diǎn)，在玉米種子純度和品種真實(shí)性鑒定中得到了廣泛應(yīng)用，解決了一些玉米品種利用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)無(wú)法進(jìn)行純度鑒定的難題[7]。生產(chǎn)上如何快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)地鑒定玉米雜交種子純度是一個(gè)突出的問(wèn)題[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究利用SSR技術(shù)，采用幼葉CTAB法和堿煮法提取雜交種‘家佳榮2號(hào)’的DNA，篩選出適合‘家佳榮2號(hào)’的玉米雜交種純度鑒定的SSR引物，比較2種DNA提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并人為摻入其他品種籽粒以驗(yàn)證特異引物的可靠性。同時(shí)進(jìn)行小區(qū)種植鑒定，用多種方式鑒定雜交種‘家佳榮2號(hào)’的種子純度并進(jìn)行比較?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】旨在為玉米的種子質(zhì)量管理和純度鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共4份，為‘家佳榮2號(hào)’雜交種及其父母本、‘JR02’雜交組合，材料由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)趙自仙老師提供，其中‘家佳榮2號(hào)’于2012年通過(guò)云南省品種審定，該品種抗病性、耐瘠性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，正在云南省推廣應(yīng)用；‘JR02’是玉米新組合，與‘家佳榮2號(hào)’同母異父，用于人為摻假鑒定，以驗(yàn)證篩選出引物的可靠性。試驗(yàn)用的種子均由隨機(jī)抽樣所得，引物為20對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物序列(表1)。

表1 引物名稱及編號(hào)

續(xù)表1 Continued table 1

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 本試驗(yàn)采用2種方法提取玉米基因組總DNA，140個(gè)樣品，標(biāo)號(hào)為1～140。第1種方法是幼葉CTAB提取法：取幼苗葉片200～300 mg于預(yù)冷的研缽中，加液氮充分研磨至粉末，取適量移入2.0 mL離心管；加入700 μl 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液和2 μl β-巰基乙醇，上下充分搖勻，放入65 ℃水浴鍋中，每15 min拿出顛倒混勻3次，至1.5 h后拿出靜置10 min至室溫；在離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，吸取上清液到新離心管，加入等體積預(yù)冷的氯仿異戊醇，顛倒搖晃離心管10 min，重復(fù)上一步，在4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，吸取上清液到新離心管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇，在-20 ℃下放置30 min沉淀[9]；然后置于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入70 %乙醇洗滌，旋轉(zhuǎn)離心數(shù)次，棄去乙醇；將離心管倒立于墊有濾紙的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，室溫干燥6 h以上；加入100 μl超純水或TE緩沖液，充分溶解后存于-20 ℃?zhèn)溆?。?種方法是單籽粒微量胚乳堿煮法提取DNA：將籽粒種皮沿一側(cè)輕輕切下，切1～3薄片胚乳放入PCR管中；加入100 μl提取液(0.1 mol/L NaOH)和少量甘油，蓋蓋；放入PCR擴(kuò)增儀中99 ℃，10 min；取出后，降到室溫，加入100 μl TE(1 mol/L Tris-HCl 5 mL，0.5 mol/L EDTA 1 mL，濃鹽酸調(diào)pH=2，定容至500 mL，存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA質(zhì)量檢測(cè) 每管DNA都用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，一大板(160 mL)瓊脂糖凝膠制備：①安裝好制膠器；②稱取1.6 g瓊脂糖倒入三角瓶中，在三角瓶中加入160 mL 1(TBE緩沖液并搖勻；③將三角瓶放入微波爐加熱，每隔20 s拿出搖晃，直到氣泡全部溢出，反復(fù)操作，直至溶液呈無(wú)色透明為止；④冷卻至不明顯燙手后，加入少量(7 μl)核酸染料并輕輕搖勻，防止產(chǎn)生氣泡；⑤從膠槽一側(cè)緩慢倒入槽中，迅速插入梳齒，待冷卻凝固后拔掉梳齒。將制好的凝膠放入裝有1×TBE電泳緩沖液的電泳槽內(nèi)，點(diǎn)樣，在100 V、120 mA條件下電泳40 min左右，取出凝膠并在凝膠成像系統(tǒng)儀中觀察結(jié)果。

1.2.3 引物篩選 從中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1432—2014)附錄C核心引物名單及序列中選擇前20對(duì)引物[10]，利用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳和8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)20對(duì)引物的退火溫度及擴(kuò)增效果進(jìn)行篩選。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系15 μl：10×PCRbuffer 1.5 μl；Mg2+0.9 μl；dNTP 0.3 μl；1UTaq酶0.275 μl；Primer(L+R)0.5 μl+0.5 μl；模版DNA 1 μl；ddH2O 10.075 μl。配體系的時(shí)候注意要在低溫條件下操作，并且保證實(shí)驗(yàn)臺(tái)清潔和操作的時(shí)候要盡量避免受到污染。配制完成后在反應(yīng)液上加入15 μl石蠟油(防止反應(yīng)過(guò)程中體系溶液蒸發(fā))，加蓋放入PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增。

反應(yīng)程序：第1步：94 ℃預(yù)變性4 min，1個(gè)循環(huán)；第2步：94 ℃變性45 s，退火35 s(退火溫度因引物不同而不同)，72 ℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)；第3步：72 ℃延伸7 min，1個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。

1.2.5 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 ①制膠灌膠。先把用水沖洗和乙醇擦過(guò)的玻璃板組裝在垂直電泳儀上，然后開始灌膠，配制凝膠組分見表2。灌膠時(shí)要迅速，防止氣泡產(chǎn)生。灌完膠之后輕輕插入梳子，置于通風(fēng)櫥中凝固1 h。②電泳。將1×TBE緩沖液加入電泳槽中，垂直向上拔出梳子，清除點(diǎn)樣孔中的氣泡。50 W恒功率預(yù)電泳30 min，暫停電泳儀進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)孔加4.5 μl PCR產(chǎn)物，點(diǎn)完樣后繼續(xù)電泳1.5 h。電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，凝膠會(huì)緊貼在有凹槽的玻璃板上。③銀染。先將電泳結(jié)束后脫下來(lái)的膠在ddH2O漂洗2次，每次20 s；然后在銀染液中輕輕晃動(dòng)染色10 min(避光)，用ddH2O漂洗2次，每次10 s；再在顯影液中輕輕晃動(dòng)至帶紋出現(xiàn)，用ddH2O漂洗1次，10 s；最后在10 %冰乙酸定影5 min，用ddH2O漂洗1次，20 s；在看膠臺(tái)上分析帶譜。

表2 8 %非變性聚丙烯酰胺膠

1.2.6 摻雜驗(yàn)證SSR方法可靠性 提取與‘家佳榮2號(hào)’同母異父的雜交種‘JR02’的DNA，然后分別用phi072k4引物和bnlg2291k4引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，與雜交種‘家佳榮2號(hào)’及其親本產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比。

1.2.7 田間小區(qū)種植鑒定 取與室內(nèi)SSR純度鑒定同一批次的種子樣品作為田間鑒定的標(biāo)準(zhǔn)樣品，于2015年5月21日播種于尋甸縣大河橋云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)習(xí)基地。試驗(yàn)地塊肥力中等，前作無(wú)玉米種植。小區(qū)行長(zhǎng)3 m，行距0.75 m，穴播，穴距0.42 m，每穴播2粒，種植密度63 510株/hm2，合計(jì)種植210粒，最終成株163株。根據(jù)種子檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程及國(guó)家種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，玉米大田用種的種子純度要求96.0 %以上，需種植株數(shù)為400/(100-96)株，即100株可獲得滿意結(jié)果，本次試驗(yàn)符合標(biāo)準(zhǔn)。生長(zhǎng)期間不定苗、不間苗，及時(shí)防蟲，以保證純度鑒定的真實(shí)性，田間管理如大田，于開花期和成熟期進(jìn)行純度鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交種‘家佳榮2號(hào)’及其親本的DNA提取和檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)用CTAB法和快速堿煮法2種方式提取DNA，結(jié)果表明，CTAB法提取的DNA質(zhì)量相對(duì)較高，量多，品質(zhì)好，可以長(zhǎng)期保存，只是操作步驟繁瑣，成本高，費(fèi)時(shí)費(fèi)工，而且需要種植幼苗?？焖賶A煮法操作簡(jiǎn)單，步驟少，節(jié)省成本和省時(shí)省工，但該方法提出的DNA的質(zhì)和量都比CTAB法提出的要差，蛋白質(zhì)含量較高，不能長(zhǎng)期保存，也不能用于大量實(shí)驗(yàn)，會(huì)出現(xiàn)DNA時(shí)有時(shí)無(wú)的現(xiàn)象。所以進(jìn)行大量純度鑒定實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好選用幼葉CTAB法提取DNA，這樣結(jié)果的可靠性較高[11]。

圖1 玉米雜交種‘家佳榮2號(hào)’DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)圖(CTAB法)Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis diagram for corn hybrid ‘Jiajiarong No.2’(CTAB method)

圖2 玉米雜交種‘家佳榮2號(hào)’DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)圖(堿煮法)Fig.2 DNA agarose gel electrophoresis diagram for corn hybrid ‘Jiajiarong No.2’(Alkali cooking method)

2.2 引物篩選

從中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1432—2014)附錄C核心引物名單及序列中選擇前20對(duì)引物，利用1.5 %瓊脂糖凝膠對(duì)20對(duì)引物的退火溫度進(jìn)行初步篩選。瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物見圖3，引物為phi072k4。由圖3可見，6個(gè)溫度梯度，瓊脂糖凝膠電泳分辨率不高，擴(kuò)增帶不易分開，無(wú)法清晰看到雙親互補(bǔ)的特征譜帶。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳見圖4，依據(jù)親本帶互補(bǔ)原則篩選引物，根據(jù)條帶亮度、清晰度、無(wú)拖尾原則篩選引物溫度，結(jié)果表明：phi072k4引物(編號(hào)7)和bnlg2291k4引物(編號(hào)8)的擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)雙親互補(bǔ)的特征譜帶。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物Fig.3 PCR products analyzed by agarose gel electrophoresis

圖4 非變性聚丙烯酰胺膠分析PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR products analyzed by non-denaturing polyacrylamide gel

泳道M為100 bp DNA ladder；泳道1～20為材料的序號(hào)Lane M was 100 bp DNA ladder；Lanes 1 to 20 represented the number of materials圖5 引物phi072k4對(duì)‘家佳榮2號(hào)’及其親本PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.5 PCR products electrophoresis results of primer phi072k4 for ‘Jiajiarong No.2’ and its parents

泳道M為100 bp DNA ladder，泳道1～19為材料的序號(hào)Lane M was 100 bp DNA ladder；Lanes 1 to 19 represented the number of materials圖6 引物bnlg2291k4對(duì)‘家佳榮2號(hào)’及其親本PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.6 PCR products electrophoresis results of primer bnlg2291k4 for ‘Jiajiarong No.2’ and its parents

2.3 樣品SSR純度鑒定

如圖5～6所示，SSR標(biāo)記可以準(zhǔn)確地區(qū)分雜交種‘家佳榮2號(hào)’及其父母本，用引物phi072k4對(duì)‘家佳榮2號(hào)’進(jìn)行純度鑒定時(shí)，共提取140株幼苗DNA，共檢測(cè)出5株雜株。用引物bnlg2291k4對(duì)‘家佳榮2號(hào)’進(jìn)行純度鑒定時(shí)，同樣的140株幼苗DNA，共檢測(cè)出4株雜株。根據(jù)朱國(guó)奇等人的研究[12]，選用純度較低的結(jié)果為準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算。玉米雜交種‘家佳榮2號(hào)’的種子純度為(140-5)/140×100 %=96.4 %。為了避免在PCR擴(kuò)增階段出現(xiàn)其他不可預(yù)知的干擾或者錯(cuò)誤對(duì)純度的結(jié)果造成影響，用同樣的DNA進(jìn)行第2次擴(kuò)增，就是重復(fù)PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。第2次的結(jié)果與第1次的相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

泳道M為100 bp DNA ladder，泳道1～5為材料的序號(hào)Lane M was 100 bp DNA ladder；Lanes 1 to 5 represented the number of materials圖7 引物phi072k4對(duì)‘家佳榮2號(hào)’及其親本和‘JR02’PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.7 PCR products electrophoresis results of primer phi072k4 for ‘Jiajiarong No.2’, its parental and ‘JR02’

泳道1～7為材料的序號(hào)Lanes 1 to 7 represented the number of materials圖8 引物bnlg2291k4對(duì)‘家佳榮2號(hào)’及其親本和‘JR02’PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.8 PCR products electrophoresis results of primer bnlg2291k4 for ‘Jiajiarong No.2’, its parental and ‘JR02’

2.4 人為摻雜驗(yàn)證

從圖7～8可見，篩選出的phi072k4、bnlg2291k4引物能夠明顯區(qū)分出‘JR02’摻雜粒。圖7為引物phi072k4對(duì)JR02的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，可知‘JR02’比‘家佳榮2號(hào)’的擴(kuò)增產(chǎn)物少了一條父本帶，一共摻雜3粒，全部均能檢測(cè)出來(lái)。圖8為引物bnlg2291k4對(duì)‘JR02’的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，‘JR02’比‘家佳榮2號(hào)’的擴(kuò)增產(chǎn)物多了一條清晰的帶，一共摻雜3粒，均能全部被檢測(cè)出來(lái)。

2.5 田間小區(qū)種植鑒定

‘家佳榮2號(hào)’于2015年7月23日抽雄，7月25日抽絲，第1次于7月26日進(jìn)行純度鑒定，鑒定了163株，異形株數(shù)為0，以成熟期鑒定結(jié)果為準(zhǔn)。第2次鑒定于2015年10月3日，根據(jù)植株高矮、株型及果穗形狀、粒色、粒刺的有無(wú)、粒型等，結(jié)合果穗大小等性狀進(jìn)行鑒定，‘家佳榮2號(hào)’總計(jì)163株，自交系4株，無(wú)其他異形株，純度(163-4)/163×100 %=97.5 %。

3 討 論

玉米雜交種純度鑒定對(duì)玉米種子質(zhì)量管理具有重要意義；同時(shí)，隨著玉米商業(yè)育種效率的提高和二環(huán)系選育的廣泛應(yīng)用，現(xiàn)在很難找到一對(duì)SSR引物能鑒定玉米雜交種純度，所以往往采用少數(shù)引物的組合。玉米SSR標(biāo)記具有豐富的多態(tài)性，利用已經(jīng)研發(fā)出的近2 000對(duì)玉米SSR引物，可以篩選出任何一個(gè)玉米雜交種純度鑒定的相應(yīng)的SSR引物。本試驗(yàn)從20對(duì)SSR標(biāo)準(zhǔn)引物中篩選出2對(duì)引物能對(duì)‘家佳榮2號(hào)’進(jìn)行純度鑒定，可以滿足‘家佳榮2號(hào)’的純度鑒定[13]。若將引物的數(shù)目增加，可能還能找到更多的適宜引物。SSR標(biāo)記數(shù)量多，具有很高多態(tài)性，帶型易于區(qū)分判斷，能區(qū)分純合基因型和雜合基因型，是一項(xiàng)很有潛力的技術(shù)，但是在SSR分析前，需要對(duì)物種進(jìn)行一系列分析。在本研究中，采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳通過(guò)銀染顯色檢測(cè)，該方法的分辨率比變性聚丙烯酰胺凝膠低，但降低了試驗(yàn)成本與危險(xiǎn)性，且分辨率高于瓊脂糖凝膠，8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠能滿足玉米純度的分析研究[14]。

田間小區(qū)種植鑒定是監(jiān)控品種是否保持特有的特征特性或符合種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的主要手段之一。在田間小區(qū)鑒定時(shí)，品種特征、特性豐富，性狀多種多樣，鑒定可靠，對(duì)異花授粉作物純度鑒定尤為重要[15]，所以田間小區(qū)種植鑒定是目前種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)和管理最重要、準(zhǔn)確、可靠的純度和真實(shí)性鑒定方法。但是該方法的鑒定周期較長(zhǎng)，還會(huì)受到環(huán)境的影響，在田間管理和種植方面的要求較高，對(duì)檢驗(yàn)員的田間鑒定經(jīng)驗(yàn)、品種特征特性熟練程度要求也高。

4 結(jié) 論

通過(guò)2種DNA提取方法的結(jié)果比較可知，幼葉CTAB法提取的DNA比較適合用于玉米種子純度的分子鑒定。通過(guò)篩選引物、PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)等環(huán)節(jié)，找到了玉米雜交種‘家佳榮2號(hào)’種子純度鑒定的特異性引物為phi072k4(編號(hào)7)和bnlg2291k4(編號(hào)8)，根據(jù)雙親帶型特征，鑒定出雜交種‘家佳榮2號(hào)’的種子純度為96.4 %(根據(jù)引物phi072k4)。摻雜實(shí)驗(yàn)中，一共摻雜6粒異品種的籽粒均能被全部檢測(cè)出來(lái)。小區(qū)種植鑒定試驗(yàn)的純度為97.5 %，室內(nèi)分子鑒定和小區(qū)種植鑒定的結(jié)果一致，表明研究結(jié)果可靠，方法正確。本研究建立了一套簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、可靠并能夠滿足SSR標(biāo)記對(duì)玉米雜交種純度鑒定的DNA提取方法，為玉米種子質(zhì)量控制和純度鑒定提供了參考依據(jù)。