重組LHCⅡ與葉綠素a的體外結合及其光電性能表征

侯琪琪, 于 倩, 李 泉, 李榮貴, 秦 松, 葛保勝

(1. 青島大學 生命科學學院, 青島 266071; 2.中國石油大學(華東)生物工程與技術中心, 青島 266555; 3. 中國科學院 煙臺海岸帶研究所, 煙臺 264003)

LHCⅡ(Light harvesting complex Ⅱ)是植物光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)中的一類重要的捕光色素-蛋白復合物，又稱捕光天線復合物，是類囊體膜蛋白中含量最豐富的蛋白，約占類囊體膜蛋白總數(shù)的30%，結合葉綠體中大約50%的葉綠素[1]。據(jù)報道，一個LHCⅡ分子可以結合14個葉綠素分子，其中包括8個葉綠素a和6個葉綠素b[2]。葉綠素a/b的選擇性結合主要取決于其結合位點周圍氫鍵供體的性質，如LHCⅡ的葉綠素結合位點周圍的谷氨酰胺側鏈酰胺基可以作為供體，與葉綠素b的C7-甲?；纬蓺滏I，而亮氨酸的非極性側鏈更適合與葉綠素a分子的C7-甲基結合[3]。

研究表明，在植物光合系統(tǒng)中的色素-蛋白復合物能夠高效捕獲太陽能，并將其通過光合作用轉化為化學能[4]。隨著染料敏化太陽能電池的深入研究，生物基的染料敏化太陽能電池凸顯出更多的優(yōu)勢，如捕光效率高、天然無污染等[5]。同時，捕光天線復合物還能夠在弱光條件下吸收光能，然后由天線復合物吸收的光能又轉移到光反應中心PSⅠ或者PSⅡ[6-8]。PSⅡ中的捕光復合物LHCⅡ在光能向PSⅡ或者PSⅠ的轉移過程中起到了關鍵的作用，相對其他的光合蛋白，LHCⅡ不僅捕光效率高，還更加穩(wěn)定[9]?？茖W家已經嘗試將LHCⅡ固定在光電陽極上，以期深入了解該色素-蛋白復合物光電流產生的機理，人們希望能夠通過模擬該系統(tǒng)將光能轉變成可供人類使用的電流[10]。然而，天然提取LHCⅡ過程中，不僅操作步驟繁多，收率較低，而且需要用表面活性劑將LHCⅡ從類囊體膜上溶解下來，往往會造成LHCⅡ的結構破壞。因此，以上因素極大地限制了LHCⅡ的大規(guī)模制備及其應用。

本文利用基因工程技術將萊茵衣藻lhcII基因在大腸桿菌中進行過量表達，經純化獲得重組LHCⅡ蛋白，并在體外與葉綠素a進行重建，將得到的色素-蛋白復合物吸附在TiO2電極上，組裝生物基染料敏化太陽能電池，進行光電表征，并將其與葉綠素a敏化太陽能電池進行對比，從而為LHCⅡ敏化的生物基太陽能電池提供重要的工作參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用萊茵衣藻lhcⅡ基因(NCBI Accession：P27523.1)由通用生物有限公司合成；所用EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)和載體pET-28a由本實驗室保存；TaqDNA、限制性內切酶BamH I、SacI、T4 DNA ligase、10×Loading buffer、D2000 DNA Ladder等均購自Takara公司；普通質粒小提試劑盒購自天根生物科技有限公司；TiO2電極片購自大連七色光科技有限公司。

NanoDrop 2000 spectrophotometer(Thermo)；AKTA 蛋白純化系統(tǒng)(GE)；UV-1700型紫外可見分光光度計(SHIMADZU)；FluoroMax-4熒光光譜儀(Horiba Jobin Yvon)；質譜儀 MALDI-TOF(Bruker)；太陽能測試系統(tǒng)(美國頤光科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取質粒

將商業(yè)合成公司提供的pUC19-lhcII質粒和本實驗室保存的空載體pET-28a分別轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，過夜培養(yǎng)后提取質粒。質粒的提取根據(jù)天根普通質粒小提試劑盒說明書中的步驟進行操作。提取后的質粒用NanoDrop 2000 spectrophotometer測定濃度，pUC19-lhcⅡ平均濃度為166.5 ng/μL，pET-28a的平均濃度為79.2 ng/μL。

1.2.2 目的基因與載體的雙酶切及連接

將pUC19-lhcⅡ質粒和pET-28a質粒分別用SacⅠ和BamHⅠ進行雙酶切后，經瓊脂糖凝膠電泳純化并回收DNA產物。

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將膠回收得到的目的基因與載體按照5∶1比例進行混合，經T4 DNA連接酶16℃連接過夜，從而構建表達載體pET-28a-lhcⅡ，將重組質粒導入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，進行單克隆培養(yǎng)，并測序。

1.2.3 擴大培養(yǎng)、目的蛋白純化及表征

測序結果正確后，將目的基因提取質粒，轉化進大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，在100 mL的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，將種子液按照1∶100的比例接入1 L的TB培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD=0.8左右時，加入2 mmol/L的乳糖進行誘導，誘導后18℃培養(yǎng)18～20 h后，收集菌體。

利用Ni2+親和色譜柱純化法進行蛋白純化。后期表征，發(fā)現(xiàn)蛋白易形成包涵體，所以用含8 mol/L尿素的Buffer將包涵體溶解，上樣后移至AKTA蛋白純化系統(tǒng)，用含有2 mol/L尿素的洗脫液進行蛋白洗脫并脫鹽，除去尿素后復性。將純化出的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳和質譜分析。

1.2.4 LHCⅡ與葉綠素a的體外結合

將上述純化獲得的LHCⅡ重組蛋白，經脫鹽柱交換buffer到重組緩沖液中，按照如下的重組方法進行結合重組：首先從螺旋藻中提取葉綠素a[11]，然后取400 μg從大腸桿菌中提取的重組LHCⅡ蛋白，溶解在1000 μL的重組Buffer中(含有100 mmol/L的Tris-HCl，pH 9.0，5 mmol/L的DTT，1 mmol/L的PMSF，12.5%的蔗糖和2%的LDS)。將該蛋白溶液于100℃加熱3 min，超聲10 min，隨后加入100 mmol/L二硫蘇糖醇及70 μL的色素乙醇溶液(3.5×10-5mol/L)，將混合物再超聲10 min。通過冰凍(1 h，-20℃)和解凍(30 min，室溫)3個循環(huán)周期，實現(xiàn)蛋白與色素的重建[12]。反復凍融結束后，將樣品放在冰上孵育15 min，最后將混合物放置在含有10 mmol/L HEPES的10 mL的蔗糖梯度(0.2～1 mol/L)中，35 700 r/min離心16 h[13]。將下游含有重建的色素-蛋白復合物的綠色帶(在約0.4 mol/L的蔗糖密度處)用注射器小心收集起來。將收集好的色素-蛋白復合物利用紫外分光光度計和熒光光譜儀進行檢測。

1.2.5 結合率曲線測定

據(jù)報道，螺旋藻中主要含有葉綠素a[14]，因此可以根據(jù)朗伯比爾定率進行葉綠素濃度的計算：A=Εbc，其中A為吸光度，Ε為吸收系數(shù)，葉綠素a在95%乙醇溶液中，在664 nm處的吸光系數(shù)為84.6[15]，b為樣品濃度(g/L)，c為光程(1 cm)。

蛋白濃度的測定采用Bradford(考馬斯亮藍法)[16]，操作方法根據(jù)Bradford試劑盒(TIANGEN)說明書操作，目的蛋白的分子質量為27 829.48 u。

1.2.6 光電性能表征

將重建后的色素-蛋白復合物和同濃度的純葉綠素a溶液進行光電性能表征，比較兩種生物基染料敏化劑的光能傳遞效率。經過紫外分光光度計的測定，LHCⅡ中葉綠素a的濃度為4.5×10-5mol/L，配置同濃度的葉綠素a溶液。將活化后的染料敏化太陽能電池的TiO2電極片分別放入上述兩種溶液中，在暗處吸附24 h后，組裝太陽能電池，安裝在太陽能測試系統(tǒng)(美國頤光科技有限公司)上進行測試[17]。

2 結果與分析

2.1 目的基因與載體雙酶切

pET-28a空質粒和攜帶目的片段的pUC19-lhcⅡ質粒經雙酶切后分別進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1所示。從圖中可以看出酶切后在約3、6和1 kb偏下處出現(xiàn)3個明顯的DNA條帶。泳道1在6 kb處出現(xiàn)明顯DNA條帶，質粒載體pET-28a的分子量為5369 bp，由電泳圖中可以看出酶切后的質粒分子量在5 kb到6 kb之間，與理論值相符，證明該質粒酶切成功。泳道2中3 kb處應為pUC19載體；lhcⅡ目的基因片段分子量為687 bp，故該泳道1 kb以下處為lhcⅡ目的基因條帶，該條帶分子量與理論值基本相符，證明酶切也得到相應的目的基因片段。將DNA片段回收連接后，酶連接產物送上海生工公司測序后，比對測序結果后發(fā)現(xiàn)均正確，因此可以得知目的基因lhcⅡ與載體pET-28a已成功連接，可以將備份菌液活化提取質粒轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21中，進行菌株的擴大培養(yǎng)和蛋白的純化。

圖1 pET-28a和pUC19-lhcⅡ質粒雙酶切后瓊脂糖電泳圖

M:雙酶切Marker；1:pET-28a；2:pUC19-lhcⅡ

2.2 SDS-PAGE電泳和質譜分析

將所培養(yǎng)收集到的菌體破碎離心后，利用Ni2+親和色譜法從上清中提取目的蛋白，經洗脫純化后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白濃度較低，僅為0.12 mg/mL。經SDS-PAGE(如圖2-A)分析發(fā)現(xiàn)，洗脫產物中僅存在少量目的蛋白，且純度不高。包涵體組分里存在明顯的LHCⅡ目的蛋白條帶，因此判定該蛋白主要表達存在于包涵體中。因此將包涵體組分用8 mol/L尿素溶解后，利用Ni2+親和色譜法，從包涵體中純化目的蛋白。

由圖2-A發(fā)現(xiàn)，經包涵體純化后，條帶6和7只有一條位于28 ku左右的條帶，可知從包涵體中提取的蛋白較純，基本無雜蛋白。由圖2-B質譜圖可以看出，目的蛋白分子量為27 871.968 u，與理論蛋白分子量27 829.48 u基本符合，可以確定已成功分離純化獲得目的蛋白LHCⅡ。

圖2 經Ni2+親和色譜純化后各蛋白組分的SDS-PAGE電泳圖(A)和目的蛋白LHCⅡ質譜圖(B)

M：Marker；1：破碎液上清；2：流穿液；3：從可溶性組分純化的目的蛋白；4：包涵體；5：包涵體組分流穿液；6-7：包涵體組分洗脫的目的蛋白

2.3 LHCⅡ與葉綠素a的體外結合

將所獲得的色素-蛋白復合物進行蔗糖密度梯度(0.2～1.0 mol/L)離心，結果(如圖3)顯示，葉綠素a由于分子量小被分離到蔗糖梯度的上層，而色素-蛋白質復合物由于分子量大可以被分離到下層從而與葉綠素a分開。由圖3可以看出，在蔗糖梯度最上層有被分離出的未結合的游離葉綠素a，而在蔗糖梯度約0.4 mol/L位置有綠色的條帶，初步判斷是結合上葉綠素a的LHCⅡ復合物。用注射器將中間的綠色條帶小心吸出，并用紫外和熒光進行檢測(如圖4)。

圖3 蔗糖密度離心

A：經脫鹽柱分離后的色素蛋白復合物；B：未經脫鹽柱分離的色素蛋白復合物

通過紫外分光光度計分析可知，游離葉綠素a分子在418 nm和660 nm處有紫外吸收峰，280 nm處并沒有明顯的紫外吸收峰。而重建后所分離得到的色素-蛋白復合物，在280 nm處有明顯的蛋白峰，相對于從螺旋藻中提取的葉綠素a而言，體外重組的LHCⅡ復合物在415 nm處的吸收峰有3 nm的藍移，在662 nm處的吸收峰有2 nm的紅移。因此可以說明LHCⅡ和葉綠素在體外已經有效結合。

為進一步證明LHCⅡ與葉綠素a的成功結合，我們對復合物進行熒光光譜的檢測。經在418 nm處進行激發(fā)，重組色素蛋白復合物最大發(fā)射峰在671 nm，與天然LHCⅡ相符。進一步說明LHCⅡ與葉綠素a在體外重建成功。

圖4 葉綠素a和色素-蛋白復合物的紫外吸收光譜(A)和色素-蛋白復合物的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜(B)

2.4 結合率飽和曲線的測定

為了進一步驗證重組LHCⅡ蛋白與葉綠素a的結合效率，我們對二者結合的飽和曲線進行了測定。所用蛋白在595 nm處的吸光度為0.262，根據(jù)Bradford蛋白定量方法所得標準曲線Y=X+0.0045(圖5-A)，計算的蛋白質含量為0.2575 mg/mL，即9.25 mmol/L。所加入葉綠素a含量的計算方法參照1.2.5中所述，隨著加入的葉綠素a與蛋白的比值的增高，色素-蛋白復合物中，蛋白結合的葉綠素a的變化趨勢如圖5-B所示。隨著加入的葉綠素a與LHCⅡ的比值的增加，在重建的色素-蛋白復合物中葉綠素a與LHCⅡ的結合率也不斷增加，最終，結合率在8.0左右達到平衡，因此認為通過基因工程手段得到的LHCⅡ最多可以結合8個葉綠素a。這也與天然LHCⅡ蛋白可以結合8個葉綠素a分子相符，這表明重組LHCⅡ具有與天然LHCⅡ同樣的葉綠素結合能力。

圖5 葉綠素a和LHCⅡ結合曲線的計算

A：Bradford蛋白定量BSA標準曲線；B：葉綠素a與LHCⅡ的結合曲線

2.5 光電性能表征

將上述重建獲得的色素-蛋白復合物和相同濃度的葉綠素a分子，按照1.2.6所述方法吸附到納米TiO2電極上，組裝成生物基染料敏化太陽能電池，并進行光電性能表征。結果如表1，復合物和葉綠素a的I-V曲線如圖6。在AM1.5，光照強度為100 mW/cm2時，色素-蛋白復合物短路電流ISC為0.493 mA/cm2，開路電壓VOC為0.491 V，填充因子FF為0.679，效率η為0.165%；葉綠素a的短路電流ISC為0.596 mA/cm2，開路電壓VOC為0.482 V，填充因子FF為0.676，效率η為0.194%。相較下，葉綠素a表現(xiàn)出相對較好的光電性能。

表 1 染料敏化TiO2太陽能電池的性能(AM1.5,100 mW/cm2)

3 討論與結論

天然的LHCⅡ的提取工藝復雜，得率比較低，且需要使用表面活性劑將其從類囊體膜上溶解下來，容易造成LHCⅡ分子結構的破壞及葉綠素脫落[18]。本實驗成功構建pET-28a-lhcⅡ質粒，在大腸桿菌BL21中培養(yǎng)表達后，經過Ni2+親和層析獲得重組LHCⅡ目的蛋白，此方法簡單易行，成本較低，且易獲得大量的LHCⅡ蛋白。經過驗證，將從包涵體中純化的蛋白經柱上復性之后，可以在體外成功與葉綠素a進行結合，且重組后LHCⅡ復合物的紫外吸收和熒光發(fā)射光譜都與天然LHCⅡ類似，這表明復性后的重組LHCⅡ具有結合葉綠素的活性。在此基礎上，通過不斷地增加重建過程中葉綠素a的量，最終使LHCⅡ與葉綠素a的結合率達到飽和，測定了色素-蛋白結合的飽和滴定曲線。經過計算可得，每個重組LHCⅡ蛋白最多可以結合8個葉綠素a分子，與天然LHCⅡ的色素結合活性一致，這進一步證明復性后所獲得的LHCⅡ保持了與天然LHCⅡ類似的生物活性。有文獻報道，LHCⅡ的化學變性過程是可逆的[19]，這或許可以解釋經包涵體復性后的LHCⅡ可以較好地保持其生物活性的原因。

圖6 LHCⅡ復合物敏化TiO2太陽能電池的I-V曲線(A)和葉綠素a敏化TiO2太陽能電池的I-V曲線(B)

將結合8個葉綠素a的LHCⅡ和相同濃度的葉綠素a溶液分別吸附到染料敏化太陽能電池的TiO2電極上，組裝生物基染料敏化太陽能電池，經光電性能測試發(fā)現(xiàn)，重建的LHCⅡ色素-蛋白復合物和純葉綠素a都可進行完整的電子傳遞，兩種材料的光電轉換效率差別不大，葉綠素a的光電轉換效率稍高于LHCⅡ。分析其原因可能是由于葉綠素a分子質量小，同樣條件下，葉綠素a在光電陽極上的吸附效果好，所以表現(xiàn)出較好的光電性能。在此基礎之上，我們希望通過不斷地摸索，可以得到獲得效果更佳的染料敏化太陽能電池的敏化劑。本研究為大規(guī)模制備LHCⅡ并將其應用于生物基染料敏化太陽能電池奠定了重要的工作基礎。